代 鳳，毛建霏

1中國石油化工股份有限公司貴州石油分公司，貴陽 550002;2四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，成都 610066

近年來的研究表明，除作為天然色素外，花青素具有多種對人體有益的生理功能，引起人們廣泛的關(guān)注?；ㄇ嗨卦谧匀唤缫蕴擒栈幕ㄉ招问綇V泛存在，已鑒定出上千余種?；ㄇ嗨剀赵寻l(fā)現(xiàn)二十余種，常見的僅有六種。紫甘薯富含花青素類色素，主要為?；氖杠嚲蘸蜕炙幩靥擒眨谚b定出二十余種花色苷，具有優(yōu)異的穩(wěn)定性和有益的生理功能［1］。使用紫外分光光度法可方便地對總花青素含量進(jìn)行測定，但影響因素較多［2］。采用高效液相色譜法大多是定性分析，直接定量測定需要液質(zhì)聯(lián)用等復(fù)雜儀器和多種標(biāo)準(zhǔn)品，難以應(yīng)用于實(shí)際檢測工作［3］。通過水解多種花色苷為少數(shù)花青素苷元，可方便地使用高效液相色譜法對花青素進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量分析［1］。目前僅有通過一次改變一個變量(one variable at a time，OVAT)的方法優(yōu)化紫甘薯花色苷水解條件的報(bào)道，主要影響因素為溫度、鹽酸濃度和水解時間［1，4］。OVAT優(yōu)化不僅耗時，并且當(dāng)影響因素之間有交互作用時，得到的結(jié)果往往是局部最優(yōu)，具有一定的局限性［5］。響應(yīng)面法同時改變多個變量，以回歸方程作為函數(shù)估算的工具，考察各因素及其交互作用對響應(yīng)值的影響，更加準(zhǔn)確方便［5］。本文首次使用響應(yīng)面法對影響紫甘薯花色苷水解的因素進(jìn)行了考察，采用3因素3水平Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，優(yōu)化了水解時間、鹽酸濃度和水解溫度對響應(yīng)值(矢車菊素和芍藥素峰面積之和)的綜合影響，從而可以使用高效液相色譜法更加準(zhǔn)確快速地測定紫甘薯花青素苷元含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試材料

紫甘薯干粉購于當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

1.1.2 試劑

矢車菊素(Chromadex，標(biāo)準(zhǔn)品，純度95.7%);芍藥素(Chromadex，標(biāo)準(zhǔn)品，純度92.5%);濃鹽酸(西隴化工，優(yōu)級純，36% ～38%);乙腈(Fisher Scientific，HPLC 純);甲酸(TEDIA，HPLC 純);試驗(yàn)用水均為去離子水。

1.1.3 儀器

Agilent1200高效液相色譜儀，Agilent G1314B多波長紫外檢測器;電子天平(Mettler，AE240);試驗(yàn)室超純化水機(jī)(艾科浦，ACD1-2005-U);高速冷凍離心機(jī)(湖南星科科學(xué)儀器有限公司，TGL-16LM);電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司，DZKW);旋渦混合器(上海青浦滬西儀器廠，XW-80A)。

1.2 紫甘薯花色苷水解條件

取紫甘薯干粉樣品10 g于250 mL磨口錐形瓶，加入0.1 mol/L鹽酸水溶液200 mL，超聲提取半小時后8000 rpm離心5 min后取上清液備用。取1.00 mL紫甘薯花色苷提取液于25 mL磨口具刻度比色管，加入一定體積的濃鹽酸后用水定容至10.0 mL，渦旋混勻。垂直置于水浴鍋中加熱，液面高于10mL刻度線。水解一定時間后立即流水冷卻，定容至25.0 mL并搖勻。在4℃，8000 rpm離心5 min后，直接取上清液用高效液相色譜儀進(jìn)行分析。整個水解和冷卻過程在室內(nèi)弱光條件下進(jìn)行。

圖1 矢車菊和芍藥素標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)及紫甘薯樣品(b)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard solution of cyanidin and peonidin(A)and purple sweet potato sample(B)

1.3 液相色譜條件

色譜柱:waters SunFire C18，5 μm，4.6 × 250 mm;柱溫:30℃;檢測器及波長:525 nm;流動相條件:1%甲酸/水溶液+1%甲酸/乙腈溶液=82+18(體積比)，流速 0.8 mL/min，等度洗脫 10 min。該條件下典型標(biāo)樣和樣品色譜圖見圖1。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件(Design-Expert 8.0.6)對響應(yīng)面法優(yōu)化紫甘薯花色苷水解條件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫甘薯花色苷水解影響因素及水平選擇

已有一些報(bào)道證明花青素苷元在強(qiáng)酸條件下能夠耐受高溫水解［6-8］。國內(nèi)外少數(shù)關(guān)于紫甘薯花青素水解條件的報(bào)道均為 OVAT 優(yōu)化［1，4］，影響花色苷水解的條件主要因素有水解溫度、時間和鹽酸濃度［9］。Van-Den Truong等使用 3.6 mol/L 的鹽酸，100℃在液相色譜進(jìn)樣瓶中水解60 min［1］;毛建霏等使用3 mol/L的鹽酸，100℃在磨口錐形瓶中水浴水解60 min［4］;在前期的工作中，我們發(fā)現(xiàn)鹽酸濃度、水解時間和水解溫度具有顯著地相關(guān)性。水解時間隨著鹽酸濃度和水浴溫度的提高縮短。當(dāng)水浴溫度低于100℃時或者需要水解時間小于60 min時，鹽酸濃度需要進(jìn)一步加大。為節(jié)約試劑并提高處理通量，使用25 mL比色管而不使用磨口錐形瓶。采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，選擇水解溫度、水解時間和濃鹽酸濃度3個因素，每個因素3個水平，試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)表Table 1 Independent Variables and Levels for Optimization

表2 3因素3水平Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of the three-levelthree-variable Box-Behnken central composition design

2.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

矢車菊和芍藥素峰面積響應(yīng)值的變化趨勢基本一致［6］，因此以 A、B、C 為自變量，以矢車菊和芍藥素的峰面積之和為響應(yīng)值(Y)，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

2.3 二次響應(yīng)面回歸模型的建立與方差分析

對表2的結(jié)果進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型:

式1中，Y為矢車菊和芍藥素的峰面積之和，β0，βi，βii，βij分別為常數(shù)項(xiàng)、一次項(xiàng)系數(shù)、二次項(xiàng)系數(shù)和相關(guān)項(xiàng)系數(shù)，X1，X2，X3分別對應(yīng)因素 A，B，C。得出二次方程:

各因素的方差分析見表3。從表3可以看出，模型的 F值為91.40，其是噪音造成的概率小于0.01%，說明該模型是顯著的。包括各因素一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及其相互間的交互作用項(xiàng)(圖2)均為顯著(＜0.05)。失擬性非顯著(＞0.05)說明該二次模型對于當(dāng)前研究是有效的。

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

圖2 水解時間(min)、鹽酸濃度(mol/L)、水解溫度(℃)對紫甘薯花青素峰面積影響的響應(yīng)面曲線:(a)水解時間和鹽酸濃度;(b)水解溫度和鹽酸濃度;(c)水解時間和水解溫度Fig.2 Response surface plots on the sum of peak area of anthocyanidins in PSP as affected by hydrolysis time(min)，HCl concentration(mol/L)and hydrolysis temperature(℃):(a)hydrolysis time and HCl concentration at constant hydrolysis temperature;(b)hydrolysis temperature and HCl concentration at constant hydrolysis time;(c)hydrolysis time and hydrolysis temperature at constant HCl concentration

2.4 模型確認(rèn)

應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化出最佳水解條件為:時間45.8 min，鹽酸濃度 4.54 mol/L，水浴溫度 100℃，得到的花青素峰面積預(yù)測值為374.1。為驗(yàn)證RSA法的可靠性，在優(yōu)化條件下進(jìn)行了3次紫甘薯花色苷水解，得到花青素峰面積值為360.9，為理論預(yù)測值的96.5%，RSD=0.77%。為進(jìn)行比較，也采用前期OVAT優(yōu)化條件(3 mol/L鹽酸，100℃水浴水解60 min)對紫甘薯花色苷進(jìn)行水解，得到的花青素峰面積值為324.6。RSA法優(yōu)化得到的條件比前期OVAT優(yōu)化條件得到的峰面積提高了11%，并且水解時間也有所減少，說明OVAT優(yōu)化得到的結(jié)果只是局部最優(yōu)。因此將RSA方法應(yīng)用于紫甘薯花色苷水解優(yōu)化可以在減少試驗(yàn)次數(shù)的同時，得到準(zhǔn)確可靠的優(yōu)化結(jié)果。

3 結(jié)論

響應(yīng)面法是研究幾種因素間交互作用的回歸分析方法，避免了OVAT和正交設(shè)計(jì)等傳統(tǒng)方法只能處理離散的水平值，而無法找出整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值的缺陷。采用3因素3水平Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，優(yōu)化了水解時間、鹽酸濃度和水解溫度對花青素峰面積之和的綜合影響，得到紫甘薯花色苷的最佳水浴水解條件為:水解時間45.8 min，鹽酸濃度4.54 mol/L，水浴溫度100℃。在最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，響應(yīng)值為理論值的96.5%，與理論值基本相符，并高于OVAT方法優(yōu)化得到的結(jié)果，說明該響應(yīng)面法優(yōu)化方法可行。

1 Truong V，Deighton N，Roger T，et al.Characterization of anthocyanins and anthocyanidins in purple-fleshed Sweetpotatoes by HPLC-DAD/ESI-MS/MS.J Agric Food Chem，2010，58:404-410.

2 Mao JF(毛建霏)，F(xiàn)u CP(付成平)，Guo LA(郭靈安)，et al.Determination of total anthocyanidins in purple sweet potato by vis spectrophotometry.Food Ferment Technol(食品與發(fā)酵科技)，2010，46:101-104.

3 Tian Q，Konczak I，Schwartz SJ.Probing anthocyanin profiles in purple sweet potato cell line(Ipomoea batatas L.Cv.Ayamurasaki)by high-performance liquid chromatography and electrospray ionization tandem mass spectrometry.J Agric Food Chem，2005，53:6503-6509.

4 Mao JF(毛建霏)，Zhou H(周虹)，Lei SR(雷紹榮)，et al.Detection of anthocyanins content in purple sweet potato by high performance liquid chromatography.Southwest China J Agric Sci(西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào))，2012，25:123-127.

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6 Pinho C，Melo A，Mansilha C，et al.Optimization of conditions for anthocyanin hydrolysis from red wine using response surface methodology(RSM).J Agric Food Chem，2010，59:50-55.

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