陳 怡 萬建新 吳可貴 許昌聲 (福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，福建 福州 350005)

目前慢性腎臟病(CKD)最主要的并發(fā)癥也是最重要的死亡原因就是心血管疾病，是CKD治療中艱巨的難題〔1〕。過氧化脂質(zhì)體增殖激活受體(PPARs)及其配體能提高組織對胰島素的敏感性，用于治療糖尿病腎病(DN)，并且能降低血壓、調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化、抗炎癥等〔2〕。另外，PPARs及其配體還具有更為廣泛的心血管保護作用，通過改善胰島素抵抗、糾正脂質(zhì)代謝紊亂、逆轉(zhuǎn)心肌肥厚、抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖與遷移，從而改善心血管的病理性重構(gòu)，可能在代謝綜合征及其并發(fā)的心血管損害中發(fā)揮重要的負性調(diào)控作用。羅格列酮是過氧化脂質(zhì)體增殖激活受體γ(PPAR-γ)激動劑，在臨床上已用于治療糖尿病，但最近Nissen等〔3〕發(fā)表了一項有關羅格列酮的最新薈萃分析結(jié)果，表明羅格列酮可顯著增加患者心肌梗死危險，結(jié)果提示羅格列酮有不利的獲益風險比，羅格列酮的安全性問題凸顯出來，但目前尚無定論。而我們前期的研究表明羅格列酮可改善慢性腎衰竭大鼠左心室肥厚〔4〕，本研究目的在于觀察不同劑量的羅格列酮對腎大部切除大鼠心肌單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)表達的影響，研究羅格列酮對慢性腎衰竭大鼠心臟保護作用的機制，為羅格列酮對CKD患者心血管并發(fā)癥的防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 羅格列酮(文迪雅)由葛蘭素史克公司生產(chǎn)。由北京中山生物試劑公司購買免疫組化試劑盒及各抗體。由北京北方生物技術(shù)研究所購買放射免疫檢測試劑盒。由Fermentas公司購買逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，由TaKaRa生物工程有限公司購買Premix Taq酶。

1.2 實驗動物及分組 雄性SD大鼠32只(購買自福建醫(yī)科大學實驗動物中心)，體質(zhì)量(220±20)g。分為兩大組，假手術(shù)組(n=8)和腎大部切除組(n=24)。手術(shù)后3 d再將存活的腎大部切除手術(shù)組大鼠24只隨機分成3組，腎大部切除組(NX組);腎大部切除加小劑量羅格列酮治療組(XL組);腎大部切除加三倍劑量羅格列酮治療組(DL組)，每組8只。

1.3 實驗方法

1.3.1 給藥 XL組予羅格列酮5 mg·kg－1·d－1灌胃;DL組，予羅格列酮15 mg·kg－1·d－1灌胃。假手術(shù)組和腎大部切除組每日予等量自來水灌胃。

1.3.2 慢性腎衰竭大鼠模型(腎大部切除大鼠)的建立 按照本課題組前期成功制模經(jīng)驗建立動物模型及假手術(shù)組〔4〕。

1.3.3 標本處理 喂養(yǎng)8 w后以斷頭法處死動物，開胸取心臟，沿房室環(huán)剪去心房及右心室游離壁，取部分左心室左冠狀面中部心肌組織放入10%中性甲醛液中固定保存用于制作石蠟切片，其余心肌組織放入－70℃液氮中保存。

1.3.4 放射免疫檢測 血清血管緊張素Ⅱ(A2)的檢測采用放射免疫方法。

1.3.5 心臟病理檢查 取心肌組織蠟塊切片后(4 μm)行HE染色，光鏡下觀察心肌的病理變化并攝片。

1.3.6 免疫組化 心肌組織MCP-1采用SP法免疫組化染色。一抗為山羊抗鼠MCP-1多克隆抗體，滴度為1∶100。按試劑盒說明書操作，以PBS代替一抗作空白對照。鏡下觀察細胞以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色為陽性信號。由攝像系統(tǒng)提取數(shù)值化細胞圖像，利用病理圖像分析系統(tǒng)進行分析，測定該區(qū)域面積的平均積分光密度值(OD值)，平均每張切片在高倍鏡下(×200)隨機選擇6個視野。

1.3.7 RT-PCR 按Trizol試劑說明提取心肌組織總RNA。以2 μg mRNA為模板，進行 RT-PCR分析，反轉(zhuǎn)錄及 PCR方法，參見試劑盒說明。所用引物序列:TGF-β1上游引物為5'-CTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGC-3'，下游引物為 5'-CACGATCATGTTGGACAACTGCTCC-3'，擴增產(chǎn)物 298 bp。內(nèi)參照為GAPDH，其上游引物為5'-ACCACAGTCCATGCCATCACT-3';下游引物為:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，擴增產(chǎn)物452 bp。PCR反應體系總體積206 μl。TGF-β1 PCR反應條件為 94℃變性5 min;94℃ 30 s，58℃45 s，72℃ 1 min，循環(huán)32 次;72℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳30 min，紫外燈下拍照，以White/Ultraviolet Transilluminator系統(tǒng)軟件分析圖像，目標條帶與內(nèi)參照光密度的比為mRNA表達強度。

2 結(jié)果

2.1 羅格列酮對大鼠血清A2的影響 術(shù)后8 w，與假手術(shù)組相比，各腎大部切除手術(shù)組大鼠血清A2水平均顯著升高(P＜0.01)。與腎大部切除組相比，各羅格列酮治療組血清A2水平降低均有顯著性差異(P＜0.01)。見表1。

2.2 心臟病理改變 術(shù)后8 w，HE染色顯示NX組心肌組織嚴重受損:肌纖維排列紊亂，大量心肌纖維斷裂，甚至出現(xiàn)肌原纖維溶解，心肌橫紋基本消失，廣泛的心肌細胞出現(xiàn)水腫和空泡變性，細胞結(jié)構(gòu)松散，細胞間隙增大;假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)較正常，肌纖維排列比較整齊有序，心肌橫紋清晰，細胞大小、形態(tài)正常，細胞質(zhì)染色均勻，細胞核大小正常，細胞間隙正常，而DL組部分逆轉(zhuǎn)其病理損害。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌HE染色(×100)

2.3 心肌組織MCP-1的表達 術(shù)后8 w，假手術(shù)組心肌組織內(nèi)幾乎未見MCP-1表達，NX組在心肌細胞內(nèi)可見較多MCP-1表達(P＜0.01)。與NX組相比，各羅格列酮治療組心肌細胞內(nèi)MCP-1表達有所降低，以DL組的差異有顯著性(P＜0.01)。見表1、圖2。

圖2 各組大鼠心肌MCP-1表達(免疫組化，×200)

2.4 心肌組織TGF-β1 mRNA的表達 術(shù)后8 w，與假手術(shù)組相比，各腎大部切除手術(shù)組大鼠心肌組織TGF-β1 mRNA的表達顯著升高(P＜0.01)。與腎大部切除組相比，各羅格列酮治療組心肌組織TGF-β1 mRNA的表達有所降低，以腎大部切除加三倍劑量羅格列酮治療組的差異有顯著性 (P＜0.01)。見表1、圖 3。

表1 羅格列酮對大鼠血清A2、心肌MCP-1、TGF-β1 mRNA 的影響(±s，n=8)

表1 羅格列酮對大鼠血清A2、心肌MCP-1、TGF-β1 mRNA 的影響(±s，n=8)

與NX組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與XL組比較;3)P＜0.05

組別 A2(pg/ml) MCP-1 TGF-β1/GAPDH假手術(shù)組713.59±160.781) 0.006 3±0.002 31) 0.076±0.0231)NX組 2 022.21±487.69 0.139 4±0.016 4 0.311±0.127 XL組 1 189.62±215.222)0.081 3±0.010 11)2) 0.109±0.0342)DL組 854.05±215.221)0.061 7±0.013 81)3)0.063±0.0321)3)

3 討論

CKD患者是心血管疾病的高危人群，可導致心腦血管疾病的高發(fā)病率和高病死率。近年來的研究提示羅格列酮能抑制心肌成纖維細胞增殖〔5〕。曲格列酮、吡格列酮、羅格列酮能抑制A2誘導的心肌細胞表面積的增加以及骨骼肌肌動蛋白、心鈉肽基因表達的上調(diào);也能抑制壓力負荷誘導的兩種動物模型的心臟體重比增加、室壁厚度增加及心肌細胞直徑增加〔6〕。但尚無有關羅格列酮對慢性腎臟病的心血管并發(fā)癥的研究。我們的前期研究表明:羅格列酮能改善慢性腎衰竭大鼠的高血壓，減少蛋白尿、降低血BUN、Scr，改善腎組織的病變，呈劑量依賴性的腎臟保護作用。同時羅格列酮可改善其左心室肥厚及抑制心肌組織膠原纖維沉積、減輕心肌組織纖維化，其機制可能與調(diào)節(jié)內(nèi)皮素、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)有關〔4〕。

心肌纖維化是指由于各種因素致心肌間質(zhì)膠原纖維結(jié)構(gòu)和含量的改變，使心肌僵硬度增加、導致心室收縮和舒張功能改變、冠狀動脈硬化，最終導致高血壓、心肌梗死、心力衰竭、心律失常、心源性猝死等多種心血管疾病，因此，防止甚至進一步逆轉(zhuǎn)心肌纖維化已成為目前心血管疾病防治的重要課題〔7〕。在心肌纖維化的發(fā)展過程中，細胞因子是重要的參與因素，TGF-β和結(jié)締組織生長因子(CTGF)等均參與心肌細胞膠原代謝，是最后導致心肌纖維化的一種中介物〔8〕。TGF-β在心室重構(gòu)包括心肌細胞肥大、成纖維細胞增生及遷移、膠原網(wǎng)架改建中具有重要作用。在心臟心肌細胞、成纖維細胞中均有TGF-β表達。病理性增多的TGF-β可以誘導心肌成纖維細胞產(chǎn)生蛋白聚糖、纖維連接蛋白和各種膠原蛋白等細胞外基質(zhì)，加速心肌纖維化。體外實驗發(fā)現(xiàn)，TGF-β對心肌細胞的效應完全類似于慢性左心室心肌纖維化、肥厚、衰竭、重構(gòu)的病理生理過程。同時，在心肌纖維化的發(fā)展過程中，A2的水平與TGF-β的表達高度相關，A2可激活Smads信號轉(zhuǎn)導通路，刺激TGF-β病理性增高，促進纖連蛋白及I、Ⅲ型膠原的合成，導致心肌纖維化進展〔9〕。已有報道，A2的多種生物學效應與下調(diào) PPARs相關〔10〕。本研究推測羅格列酮對腎大部切除術(shù)大鼠心臟保護作用可能與下調(diào)A2，抑制大鼠心肌組織TGF-β1的表達有關。

MCP-1是調(diào)節(jié)免疫反應的重要因子，可促進單核細胞的分化、聚集到炎癥部位、增加滲出，還能夠增加巨噬細胞超氧負離子的產(chǎn)生并誘發(fā)溶酶體酶的釋放，從而加重心肌缺血再灌注損傷。前壁心肌梗死小鼠(結(jié)扎左冠狀動脈)建模4 w后，心肌MCP-1 mRNA的表達增加;而在建模前3 d和建模后14 d，予變異的MCP-1基因轉(zhuǎn)導小鼠以后，前壁心肌梗死小鼠的MCP-1信號轉(zhuǎn)導被阻斷，其4 w存活率明顯提高，左心室擴張減輕、心肌纖維化改善、巨噬細胞聚集減少、心肌TNF-α的表達減輕。提示MCP-1表達的激活不利于心肌梗死后心室重構(gòu)的改善，可導致慢性心衰竭〔11〕。另外，體外實驗提示，羅格列酮可呈濃度依賴的抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞系(HUVEC-12)中由A2所誘導的MCP-1的表達〔12〕。本實驗推測，羅格列酮下調(diào)A2，抑制大鼠心肌內(nèi)MCP-1的過度表達從而對腎大部切除大鼠心臟起到保護作用。

近年來，有關羅格列酮的心臟安全性問題爭論激烈，但尚無定論。長達5年的RECORD研究，納入了約4 500例糖尿病患者，結(jié)果顯示，與二甲雙胍或磺脲類相比，羅格列酮并不增加總體心血管住院或心血管死亡風險，在心肌梗死、卒中或任何類型死亡的次要終點方面，兩組無顯著差異〔13〕。RECORD研究數(shù)據(jù)清楚地表明，羅格列酮與活性對照藥物具有相當?shù)男难馨踩浴?型糖尿病旁路血管成形血運重建研究(BARI 2D)的研究結(jié)果也進一步證實了這一結(jié)論:在經(jīng)證實的冠狀動脈疾病患者中，胰島素增敏劑羅格列酮與胰島素供給療法相比，并不增加主要的復合終點事件(死亡或主要心血管事件)〔14〕。動物實驗提示梗死心肌重構(gòu)過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達上調(diào)，細胞間基質(zhì)纖連蛋白(FN)被降解;激活PPAR-γ可能通過抑制MMP-9的表達，減輕FN的降解，從而改善心肌重塑〔15〕。我們的研究也提示通過羅格列酮的干預，腎大部切除大鼠的左心室肥厚得到改善。我們既往的研究提示〔16，17〕，羅格列酮可保護腎功能、延緩腎臟病變進展。我們推測，由于慢性腎衰竭的進展得到延緩，腎大部切除大鼠左心室肥厚的進展也得已延緩。同時，羅格列酮可降低慢性腎衰竭大鼠腎性高血壓，下調(diào)A2，抑制心肌組織MCP-1和TGF-β1的表達，改善心肌組織中膠原纖維的沉積、減輕心肌纖維化，改善其左心室病理性重構(gòu)，從而對慢性腎衰竭大鼠的心臟起到保護作用。

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