沈 毅，趙 根，李 莉，彭彩娥

(1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江杭州 310058;2.湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江湖州 313000;3.浙江大學(xué)湖州市南太湖現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技推廣中心，浙江湖州 313000)

煙草 (Nicotiana tabacum)是茄科煙草屬一年生草本自花授粉植物，天然雜交率僅1%～3%，一般在花冠裂開前已完成授粉。利用基因調(diào)控和轉(zhuǎn)基因研究基因調(diào)控?zé)煵蓍_花的問題，不僅可縮短煙草開花時(shí)間，對(duì)煙草行業(yè)的發(fā)展也具有重要意義。

GMPase是調(diào)控?zé)煵葜锌箟难?(AsA)的重要基因，其過量表達(dá)和抑制表達(dá)對(duì)煙草葉片中氧化型和還原型AsA具有較大影響，從而影響到煙草的花期。AsA又稱Vc，是含有內(nèi)脂結(jié)構(gòu)的多元醇類，其特點(diǎn)是具有可解離出H+的烯醇式羥基，因而其水溶液有較強(qiáng)的酸性。AsA在動(dòng)植物體中具有重要的抗氧化功能和代謝功能，人體無法自身合成，新鮮蔬菜水果是人體攝入的重要來源［1］。

AsA普遍存在于植物體組織中，是一種高豐度小分子抗氧化物質(zhì)，可直接與超氧自由基(·)、過氧化氫(H2O2)和羥自由基(·OH)等發(fā)生活性氧反應(yīng)，從而達(dá)到植物體抗氧化，在抗氧化脅迫中具有重要作用［2－5］。AsA除了參與植物抗氧化外，還具有其他許多特殊的功能:參與植物細(xì)胞壁的合成、伸長(zhǎng)和交聯(lián);調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄翻譯;調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原平衡，是一種重要的氧化還原緩沖劑;作為一些酶的輔酶，調(diào)節(jié)酶的活性;調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂和伸長(zhǎng)。AsA的這些重要生理功能是與其氧化還原狀態(tài)以及生物合成、代謝、再生和轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)酶類活性的變化密切相關(guān)的［2，6－7］。

AsA通過參與植物細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)氧化還原反應(yīng)，從而達(dá)到植物細(xì)胞的抗氧化作用。AsA在細(xì)胞內(nèi)主要由抗壞血酸氧化酶 (ascorbate oxidase，AAO)和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)催化。APX以AsA為電子供體，將H2O2還原為H2O，同時(shí)將AsA氧化為單脫氫抗壞血酸MDHA;MDHA以細(xì)胞色素b為電子供體，在MDHA還原酶 (MDHAR)的作用下還原為AsA，也可進(jìn)一步生成脫氫抗壞血酸 DHA。而DHA在DHA還原酶的催化下，利用胱光甘肽為電子供體，通過抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)還原成AsA，并最終使 H2O2得以清除［3－4，8］，氧化型谷胱甘肽在谷胱甘肽還原酶的催化下，用NADPH為電子供體得以還原。細(xì)胞壁內(nèi)的AsA通過質(zhì)膜運(yùn)載體，以易化擴(kuò)散方式與DHA交換而來，并在AO的作用下被氧化為MDHA，這樣產(chǎn)生的MDHA可能被質(zhì)膜Cyt b系統(tǒng)還原;而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的AsA氧化所產(chǎn)生的MDHA有兩種途徑:進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)的抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)，或者以NADH為電子供體被定位于質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的MDHAR催化還原為AsA［9］。

本試驗(yàn)是建立在陳坤明等［5］對(duì)植物AsA的合成等研究的基礎(chǔ)上，先將野生煙草經(jīng)轉(zhuǎn)基因得到試驗(yàn)用轉(zhuǎn)基因煙草，再將野生煙草和轉(zhuǎn)基因煙草同時(shí)播種生長(zhǎng)，在相同環(huán)境下，測(cè)量其生長(zhǎng)指標(biāo)，并在特定階段，測(cè)定其葉片中過氧化物酶 (POD)和丙二醛 (MDA)含量，來研究GMPase基因?qū)煵蓍_花的影響。

1 材料與方法

以野生煙草為對(duì)照，以轉(zhuǎn)基因T1-05和T1-15煙草為試驗(yàn)煙草。播種培養(yǎng)后，測(cè)其株高、莖粗、葉面積、葉表面情況等生長(zhǎng)指標(biāo)。將野生型煙草和T1-05，T1-15轉(zhuǎn)基因型煙草經(jīng)4℃低溫和40℃高溫處理后，測(cè)定其POD含量的變化，及4℃低溫對(duì)MDA含量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)

3種試材播種后，置于人工氣候試驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)，每種煙草取16棵，每隔1周測(cè)量其生長(zhǎng)指標(biāo)1次，共5周，再取平均數(shù) (表1)。數(shù)據(jù)顯示，野生煙草在株高上比轉(zhuǎn)基因T1-05，T1-15煙草矮得多，而野生煙草幾乎沒有莖，葉片直接從底部生長(zhǎng)，無法測(cè)量其莖粗，而在葉面積上明顯比轉(zhuǎn)基因T1-05，T1-15煙草大很多，葉表面野生無毛和褶皺。而T1-05和T1-15轉(zhuǎn)基因煙草在株高、莖粗和葉面積上差異不大，葉表面隨之開始有毛和褶皺。T1-05和T1-15轉(zhuǎn)基因煙草的節(jié)間顯著長(zhǎng)于CK煙草，且葉片較薄而小，并出現(xiàn)早衰的現(xiàn)象。

表1 野生煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的表型差異

2.2 POD含量

以POD為代表的抗氧化酶系統(tǒng)和以AsA為代表的抗氧化劑組成的抗氧化系統(tǒng)對(duì)植物體內(nèi)活性氧(ROS)水平起著精密的調(diào)控作用，從而將活性氧控制在細(xì)胞可忍耐的水平。

野生型和T1-05，T1-15轉(zhuǎn)基因型煙草材料經(jīng)低溫和高溫處理后其POD含量發(fā)生明顯變化 (圖1－2)。

圖1 低溫處理對(duì)煙草POD含量的影響

圖2 高溫處理對(duì)煙草POD含量的影響

由圖1可知，隨著低溫處理，野生型煙草的POD含量迅速下降，24 h后基本平穩(wěn);而T1-05和T1-15煙草的POD含量開始表現(xiàn)為下降，24 h后呈上升趨勢(shì)。說明野生型煙草在0，24 h低溫處理的抗逆性優(yōu)于T1-05和T1-15轉(zhuǎn)基因型煙草，但T1-05和T1-15在24 h后抗逆性開始反彈。

由圖2可知，高溫處理破壞了酶活性，處理時(shí)間越長(zhǎng)，破壞程度越高，POD含量越低。但總體而言，野生型煙草的POD含量比T1-05和T1-15轉(zhuǎn)基因的高，說明總體上野生型煙草抗高溫優(yōu)于T1-05和T1-15轉(zhuǎn)基因型煙草。

2.3 MDA含量

植物體在不利的生長(zhǎng)環(huán)境下受到傷害或者衰老，都與活性氧積累誘發(fā)的膜脂過氧化作用密切相關(guān)。產(chǎn)物中的MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，可通過對(duì)其含量的測(cè)定來顯示植物膜脂過氧化的程度，間接測(cè)定膜系統(tǒng)受損情況及抗逆性。

野生型和T1-05，T1-15轉(zhuǎn)基因型煙草經(jīng)4℃低溫處理后，其MDA含量發(fā)生明顯變化 (圖3)。

圖3 低溫處理對(duì)煙草MDA含量的影響

由圖3可知，處理24 h后，3種煙草抗逆性相當(dāng);12和48 h時(shí)，T1-05和T1-15轉(zhuǎn)基因煙草抗逆性優(yōu)于野生型煙草;36 h時(shí)，野生煙草抗逆性高于T1-05和T1-15。結(jié)果表明，隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，膜系統(tǒng)受損一定程度后，就不再受破壞;野生型煙草的恢復(fù)能力和抗逆性優(yōu)于T1-05和T1-15轉(zhuǎn)基因煙草。

3 小結(jié)與討論

GMPase基因是植物合成AsA的首個(gè)關(guān)鍵酶基因，催化產(chǎn)物GDP-甘露糖可用于合成植物細(xì)胞壁的碳水化合物，在肽鏈合成的同時(shí)或合成后，還可用于糖鏈被接到肽鏈上特定的糖基化位點(diǎn) (蛋白糖基化)。GMPase基因能提高體內(nèi)AsA含量，可增強(qiáng)植物體的抗脅迫能力［10］。

與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草葉片AsA含量降低了30%～40%，表現(xiàn)出與野生煙草不同的表型。轉(zhuǎn)基因煙草植株在組培過程中就開始開花，在7～8片葉時(shí)全部開花，而野生煙草生長(zhǎng)至25～28片葉時(shí)才開始開花，轉(zhuǎn)基因煙草開花時(shí)間比野生煙草提前近1個(gè)月。在7～8片葉時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草的節(jié)間顯著長(zhǎng)于野生煙草，葉片薄且小，并出現(xiàn)早衰現(xiàn)象。

GMPase基因的抑制表達(dá)明顯降低了轉(zhuǎn)基因煙草的自身抗氧化能力，在4℃低溫和40℃高溫脅迫下，T1-05和 T1-15轉(zhuǎn)基因煙草葉片的 SOD、APX活性顯著低于野生煙草，而其葉片的MDA和H2O2含量大大超過野生煙草。上述結(jié)果證明了GMPase基因在植物體合成AsA過程中起關(guān)鍵作用，雖然GMPase不是清除活性氧的抗氧化酶，但GMPase基因的表達(dá)卻與植物的抗氧化能力密切相關(guān)［10］。

通過對(duì)煙草的植株生理性狀、POD含量、MDA含量的測(cè)定表明，野生煙草在抗逆性方面優(yōu)于轉(zhuǎn)基因煙草，GMPase基因能有效地控制AsA的合成，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)煙草花期的有效調(diào)控。

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