汪楠楠,胡 珊,吳 丹,王友保,2,*
(1.安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,蕪湖 241000;2.安徽師范大學(xué)生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蕪湖 241000)
隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)建設(shè)的騰飛,工礦業(yè)的迅速發(fā)展,環(huán)境污染問題也日益嚴(yán)峻,其中土壤的重金屬污染更是令人堪憂。在此背景下,土壤的銅污染已經(jīng)日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn),而銅污染土壤的修復(fù)和治理也作為一個(gè)全球性研究課題,吸引著眾多的學(xué)者和專家。經(jīng)過近年來的不斷探索,污染土壤的植物修復(fù)技術(shù)由于其成本低、效果顯著以及不會(huì)造成二次污染等優(yōu)點(diǎn),為解決土壤重金屬污染問題提供了一條新的綠色途徑[1]。
重金屬在土壤中一般以多種形態(tài)賦存,不同的化學(xué)形態(tài)對(duì)植物的有效性不同。重金屬生物有效態(tài)是指能被植物所吸收的那部分重金屬[2]。植物修復(fù)的首要目標(biāo)應(yīng)是減少土壤有效態(tài)重金屬濃度,而不是土壤重金屬總量,所以植物修復(fù)技術(shù)的效率在很大程度上取決于對(duì)重金屬生物有效態(tài)的吸收[3]。
研究表明,螯合劑對(duì)土壤中的重金屬有一定的活化作用,能夠通過擾動(dòng)污染物在土壤液相濃度和固相濃度之間的平衡,提高重金屬的有效態(tài)含量。這種施用螯合劑或配位基誘導(dǎo)或強(qiáng)化植物超富集作用被稱為螯合誘導(dǎo)修復(fù)技術(shù)(Chelate-induced phytoremediation)。林琦等人研究認(rèn)為,檸檬酸可降低土壤對(duì)鉛、鎘的吸附,即活化了土壤中的鉛和隔[4]。吳龍華等人對(duì)人工螯合劑EDTA進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)施用3mmol/kg EDTA大幅度提高了土壤溶液中銅、鋅、鎘和鉛的濃度[5]。
觀賞植物吊蘭(Chlorophytum comosum)隸屬于百合科吊蘭屬,具有分布性廣,環(huán)境競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)和易于栽培等特點(diǎn),對(duì)重金屬具有較好的耐性與積累特性[6]。檸檬酸(Citric acid,CA)是一種低分子有機(jī)酸,為天然螯合劑;EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸)則是人工合成螯合劑的代表性物質(zhì)。
本文采用吊蘭對(duì)土壤中的銅進(jìn)行提取,通過對(duì)相關(guān)指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)分析,初步討論了在梯度濃度檸檬酸或EDTA的影響下,銅污染土壤中吊蘭生長(zhǎng)狀況的變化,為檸檬酸和EDTA在土壤植物修復(fù)中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。
供試植物為吊蘭。2011年9月自吊蘭母枝剪下帶有氣生根的吊蘭幼苗,培養(yǎng)2周,待幼苗生根穩(wěn)定后,選取根長(zhǎng)5cm、株高8cm左右,生長(zhǎng)狀況近似的幼苗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。供試土壤來源于安徽師范大學(xué)后山,基本性質(zhì)為黃棕壤,最大持水量為60%,有機(jī)質(zhì)含量13.35g/kg,全氮、全磷、全鉀和土壤全銅含量分別為1.25、0.15、10.89、26.35g/kg。
土壤風(fēng)干后過2mm篩備用。在直徑為12.5cm的塑料花盆中分別加入上述土壤250g,在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,一次性加入CuSO4·5H2O,使土壤的初始銅含量為400mg/kg,以不添加銅的土壤作為空白組(CK),將土壤靜置2周。
靜置結(jié)束后,將吊蘭幼苗栽入實(shí)驗(yàn)組盆中,每盆2株。(每種處理各設(shè)置4盆:3盆為栽種吊蘭的實(shí)驗(yàn)組,1盆為不種吊蘭的對(duì)照組。)吊蘭栽培20d后,采用滴灌的方法施加檸檬酸或EDTA溶液。檸檬酸和EDTA分別設(shè)置了 5 個(gè)處理濃度,即 0、2.5、5、7.5、10mmol/L,施加量為 5mL/d,共 40d。待栽培結(jié)束,立即對(duì)土壤和吊蘭的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。
1.3.1 土壤全銅和有效態(tài)銅含量的測(cè)定
將花盆中的土壤倒出,風(fēng)干,過0.1mm篩備用。取土樣經(jīng)鹽酸-硝酸-高氯酸消解后,使用日本島津(SHIMADZU)AA-6800型原子吸收分光光度計(jì),以火焰原子吸收分光光度法測(cè)定其全銅含量。另取土樣經(jīng)0.1mol/L稀HCl浸泡并振蕩90min后,同樣采用火焰原子吸收分光光度法測(cè)定其有效態(tài)銅含量。
1.3.2 吊蘭銅富集量的測(cè)定
稱取烘干后的吊蘭材料粉末 0.2g,加 10mL 混酸(HNO3∶60%HCLO4∶H2SO4=8∶1∶1)浸泡過夜。次日高溫消化至溶液澄清,以0.5%HCl定容至25mL。雙層濾紙過濾,取濾液,用日本島津(SHIMADZU)AA-6800型原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度和對(duì)應(yīng)的待測(cè)液銅濃度,分別計(jì)算吊蘭地上部分和地下部分的銅含量,單位為mg/kg。
1.3.3 吊蘭形態(tài)學(xué)指標(biāo)的測(cè)定
將吊蘭從盆中連根移出,仔細(xì)清理掉附著在根系表面的土壤,并用刻度尺(最小分度單位為mm)分別量取吊蘭的根長(zhǎng)(cm)和株高(cm)。
1.3.4 吊蘭生物量的測(cè)定
將吊蘭洗凈,用剪刀從根部剪開,再用電子天平分別稱取其地上部分和地下部分鮮重(g)。
1.3.5 吊蘭葉片幾種生理指標(biāo)的測(cè)定
電導(dǎo)率(Electrical conductivity,EC):剪取吊蘭葉片0.2g,剪成1cm長(zhǎng)小段,加20mL雙蒸水浸泡,振蕩90min,用DDS-11A數(shù)顯電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)率,單位為μs/cm。
分別以TCA和丙酮提取丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和葉綠素(Chlorophyll,Chl),并用WFJ7200型可見光分光光度計(jì)測(cè)定其含量[7]。
1.3.6 吊蘭葉片抗氧化酶活性的測(cè)定
過氧化氫酶(Catalase,CAT)的活性測(cè)定采用高錳酸鉀滴定法[8]。
過氧化物酶(Peroxidase,POD)的活性測(cè)定采用愈傷木酚法[7]。
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的活性測(cè)定采用NBT光還原法[7]。
本節(jié)主要采用的是Microsoft Excel 2003和SPSS 17.0兩種軟件。使用Microsoft Excel 2003對(duì)平行樣的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行計(jì)算,同時(shí)使用SPSS 17.0進(jìn)行不同處理之間的多重比較,以及數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性分析。
如圖1所示,隨著檸檬酸施加濃度的上升,土壤全銅含量先增大后減小,且在檸檬酸濃度為7.5mmol/L時(shí)達(dá)到峰值394.9mg/kg,顯著高于不施加檸檬酸時(shí)的371.2mg/kg;在EDTA濃度為2.5mmol/L時(shí),土壤全銅的含量達(dá)到最大值384.8mg/kg,高于在相同濃度檸檬酸調(diào)節(jié)下的土壤全銅含量,而在其他濃度的EDTA處理下,土壤全銅含量均低于檸檬酸的處理結(jié)果。
土壤中重金屬的環(huán)境行為和生態(tài)效應(yīng)除了受到土壤中重金屬的總含量的影響,主要取決于其存在的形態(tài),即生物有效態(tài)。有效態(tài)一般主要是指提取的水溶態(tài)和交換態(tài)等重金屬,這部分重金屬在土壤中具有較大的活性,容易被植物所吸收利用[9]。因此,土壤有效態(tài)銅含量的變化可以直接反映檸檬酸和EDTA對(duì)銅的活化效果的優(yōu)劣。
如圖2所示,隨著檸檬酸處理濃度的上升,土壤中有效態(tài)銅的含量同樣是先增大后減小,且在檸檬酸濃度為5mmol/L時(shí)達(dá)到峰值255.4mg/kg,顯著高于不施加檸檬酸時(shí)的235.45mg/kg;EDTA對(duì)土壤銅的活化效果要低于相同濃度的檸檬酸,且土壤有效態(tài)銅含量在EDTA的影響下出現(xiàn)波動(dòng),也在濃度為5mmol/L時(shí)達(dá)到峰值 245.25mg/kg。
圖1 檸檬酸和EDTA對(duì)土壤全銅含量的影響Fig.1 Effects of CA and EDTA on content of total copper in soil
圖2 檸檬酸和EDTA對(duì)土壤有效態(tài)銅含量的影響Fig.2 Effects of CA and EDTA on content of available copper in soil
由圖1、圖2可知,低濃度的檸檬酸和EDTA能夠顯著活化土壤中的銅,而這種活化作用在高濃度水平時(shí)卻有所降低。這可能是由于高濃度的檸檬酸和EDTA會(huì)讓土壤的pH值略有下降,從而使土壤中的各種生理生化活動(dòng)都受到一定的影響,間接導(dǎo)致了這兩種螯合劑對(duì)土壤銅活化作用的減弱。
可見,檸檬酸和EDTA對(duì)土壤銅的活化作用均在濃度為5mmol/L時(shí)達(dá)到最大,且檸檬酸的活化效果更強(qiáng)。
由圖3可知,隨著檸檬酸濃度的增大,吊蘭對(duì)銅的富集量先上升后下降,地下部分富集量在檸檬酸濃度為2.5mmol/L時(shí)達(dá)到峰值1078.25mg/kg;地上部分的富集量在檸檬酸濃度為5mmol/L時(shí)達(dá)到峰值190.188mg/kg。由此可見,吊蘭的地下部分比地上部分對(duì)檸檬酸更為敏感。在EDTA的調(diào)節(jié)下,吊蘭對(duì)銅的富集量出現(xiàn)了大幅度的波動(dòng),且地下部分富集量明顯低于相同濃度條件下檸檬酸調(diào)節(jié)的吊蘭,其最大富集量出現(xiàn)在EDTA濃度為5mmol/L時(shí),為808.375mg/kg,僅為檸檬酸調(diào)節(jié)下吊蘭地下部分最大富集量的74.97%??梢钥闯?,檸檬酸比EDTA對(duì)吊蘭富集量的影響更大。
圖3 檸檬酸和EDTA對(duì)吊蘭富集作用的影響Fig.3 Effects of CA and EDTA on copper enrichment of C.comosum
由圖2和圖3可知,在檸檬酸和EDTA的作用下,吊蘭對(duì)銅富集量的變化趨勢(shì)與土壤中有效態(tài)銅含量的變化趨勢(shì)基本吻合。經(jīng)SPSS分析,在檸檬酸和EDTA的影響下,土壤的有效態(tài)銅含量與吊蘭地下部分的銅富集量為顯著性正相關(guān)(表1)。結(jié)合本章第一節(jié)的討論,可以得出以下結(jié)論:由于檸檬酸對(duì)土壤中銅的活化能力較強(qiáng),所以其對(duì)吊蘭富集作用的影響比EDTA大。
表1 土壤有效態(tài)銅含量與吊蘭對(duì)銅富集量的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of available copper in soil and copper enrichment of C.comosum
此外,生物富集系數(shù)(BC)是指植物中重金屬的濃度除以土壤的全銅濃度所得到的值。通常用來描述植物對(duì)重金屬的富集能力[10]。如圖4所示,在檸檬酸影響下吊蘭的BC曲線高于EDTA影響下的吊蘭,且值均大于1,這進(jìn)一步肯定了以上結(jié)論。為什么檸檬酸和EDTA在高濃度時(shí)會(huì)明顯抑制吊蘭對(duì)土壤銅的吸收呢?首先,由2.1部分的討論可知,
在高濃度螯合劑的影響下,土壤有效態(tài)銅的含量有所降低,這直接影響了吊蘭對(duì)銅的富集效果;其次,高濃度螯合劑施入土壤后會(huì)與陽離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物,而復(fù)雜結(jié)構(gòu)形態(tài)的重金屬生物活性較差,所以會(huì)抑制植物對(duì)其的吸收作用[11]。因此,低濃度的檸檬酸和EDTA通過活化土壤中的銅,能夠促進(jìn)吊蘭對(duì)銅的吸收;而高濃度的檸檬酸和EDTA使土壤溶液中的高穩(wěn)定螯合劑-重金屬復(fù)合物增多,反而不利于吊蘭的吸收。
2.3.1 檸檬酸和EDTA對(duì)銅污染條件下吊蘭形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響
圖4 檸檬酸和EDTA對(duì)吊蘭富集系數(shù)的影響Fig.4 Effects of CA and EDTA on bioaccumulation coefficient of C.comosum
由表2可知,吊蘭的根長(zhǎng)在檸檬酸濃度低于2.5mmol/L時(shí)下降,在檸檬酸濃度高于2.5mmol/L時(shí)數(shù)值明顯上升;吊蘭株高以5mmol/L檸檬酸為界,先減小后變大。這與檸檬酸對(duì)吊蘭地下部分和地上部分銅富集量的影響恰好相反,說明檸檬酸對(duì)土壤銅的活化作用將間接抑制吊蘭的生長(zhǎng)。
表2 檸檬酸對(duì)吊蘭形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響Table 2 Effects of CA on morphological indicators of C.comosum
本實(shí)驗(yàn)采用的土壤銅濃度為400mg/kg,接近吊蘭存活條件的臨界值,在這種水平的銅脅迫下,吊蘭生長(zhǎng)會(huì)受到一定程度的抑制。從相關(guān)性系數(shù)上看,在檸檬酸和EDTA的影響下,吊蘭根長(zhǎng)與土壤有效態(tài)銅含量呈不顯著負(fù)相關(guān),吊蘭株高則是與兩種螯合劑的濃度變化基本無關(guān)。然而,吊蘭的根長(zhǎng)和株高均在檸檬酸濃度為10mmol/L 時(shí)達(dá)到最大值,分別是 15.03、19.58cm,都超過了空白組(CK)的數(shù)值13.8、15.1cm,耐性指數(shù) TI也達(dá)到了最大值108.94%。也就是說,在高濃度檸檬酸的作用下,銅污染土壤中吊蘭的形態(tài)學(xué)指標(biāo)恢復(fù)到了正常生長(zhǎng)水平以上??梢钥闯觯瑱幟仕岜旧韺?duì)吊蘭的生長(zhǎng)可能還具有一定的促進(jìn)作用。
已知在EDTA的影響下吊蘭對(duì)土壤銅的富集量呈波動(dòng)狀態(tài)。如表3所示,隨著EDTA濃度的上升,吊蘭的形態(tài)學(xué)指標(biāo)數(shù)據(jù)也呈現(xiàn)出不規(guī)律波動(dòng)的變化趨勢(shì)。其中,根長(zhǎng)只在EDTA濃度為5mmol/L時(shí)與不添加EDTA時(shí)的值差異顯著,株高則在各個(gè)處理之間均表現(xiàn)為差異不顯著。說明EDTA對(duì)銅污染土壤中吊蘭的生長(zhǎng)沒有明顯的影響。
表3 EDTA對(duì)吊蘭形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響Table 3 Effects of EDTA on morphological indicators of C.comosum
2.3.2 檸檬酸和EDTA對(duì)銅污染條件下吊蘭生物量的影響
如圖5,與形態(tài)學(xué)指標(biāo)相似,在檸檬酸的影響下,吊蘭的鮮重水平以5mmol/L檸檬酸為轉(zhuǎn)折點(diǎn)先減小后變大;在EDTA的影響下,吊蘭的生物量大致呈現(xiàn)出了無顯著差異性的波動(dòng)。結(jié)合2.1部分的討論,吊蘭生物量的變化與吊蘭對(duì)土壤銅的富集量密切相關(guān),即吊蘭的生物量間接地與檸檬酸和EDTA對(duì)土壤銅的活化作用相關(guān)。
圖5 檸檬酸和EDTA對(duì)吊蘭生物量的影響Fig.5 Effects of CA and EDTA on biomass of C.comosum
2.3.3 檸檬酸和EDTA對(duì)銅污染條件下吊蘭葉片幾種生理指標(biāo)的影響
當(dāng)植物處于逆境時(shí),自由基增多,作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng),產(chǎn)生的大量活性氧會(huì)打破動(dòng)態(tài)平衡,給植物體造成嚴(yán)重的損傷,從而導(dǎo)致電解質(zhì)外泄。因此,電導(dǎo)率(EC)是檢測(cè)葉片損傷程度的重要指標(biāo)。而葉綠素含量(Chl)則是反映植物光合作用強(qiáng)度的指標(biāo)之一[13-14]。
由表4、表5可知,在土壤中加入檸檬酸和EDTA后,吊蘭葉片的電導(dǎo)率以較大幅度的波動(dòng)對(duì)銅脅迫產(chǎn)生應(yīng)答,且電導(dǎo)率的實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)均比空白組(CK)大。葉綠素含量則呈現(xiàn)出幅度較小的變化。由表中的相關(guān)性系數(shù)可知,兩種螯合劑對(duì)吊蘭生理指標(biāo)的影響雖不顯著,但相比而言,檸檬酸的影響要略小于EDTA。
可以看出,檸檬酸和EDTA對(duì)因土壤銅污染而受到損傷的吊蘭葉片沒有明顯的修復(fù)作用。
表4 檸檬酸對(duì)吊蘭幾種生理指標(biāo)的影響Table 4 Effects of CA on some physiological indexes of C.comosum
表5 EDTA對(duì)吊蘭幾種生理指標(biāo)的影響Table 5 Effects of EDTA on some physiological indexes of C.comosum
2.3.4 檸檬酸和EDTA對(duì)銅污染條件下吊蘭葉片的丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響
當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫時(shí),會(huì)由于自由基增多而導(dǎo)致過氧化損傷,而氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)則常被用來指示植物葉片的受損程度。如表6、表7所示,在土壤中加入檸檬酸和EDTA后,吊蘭葉片的丙二醛含量表現(xiàn)為各個(gè)處理之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)均比空白組(CK)大。
細(xì)胞中H2O2的積累能降低CO2的固定效率,尤其是H2O2和通過Haber-Weiss反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生更多的活性氧,所以及時(shí)清除H2O2對(duì)防止活性氧十分重要。在正常情況下,生物體會(huì)通過抗氧化酶的聯(lián)合作用對(duì)活性氧自由基進(jìn)行清除,以減輕機(jī)體損傷。超氧化物歧化酶(SOD)是的凈化劑,通過消除;過氧化氫酶(CAT)可將高濃度的H2O2清除;過氧化物酶(POD)可清除植物組織中產(chǎn)生的低濃度的
當(dāng)生物體受到輕度逆境脅迫時(shí),抗氧化酶活性會(huì)應(yīng)激性升高,增強(qiáng)對(duì)活性氧的清除能力;當(dāng)受到重度環(huán)境脅迫時(shí),細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的平衡遭到破壞,抗氧化酶活性會(huì)受到抑制,體內(nèi)活性氧積累,帶來機(jī)體損傷,所以抗氧化酶活性也是反映生物體對(duì)環(huán)境脅迫適應(yīng)程度的重要指標(biāo)[17]。在土壤銅濃度為400mg/kg的環(huán)境下,吊蘭的抗氧化酶活性應(yīng)該是處于受到抑制的狀態(tài)。
如表6、表7所示,在檸檬酸和EDTA的作用下,吊蘭葉片CAT的活性出現(xiàn)小幅度波動(dòng),可見檸檬酸和EDTA對(duì)銅污染環(huán)境下吊蘭CAT活性所受到的抑制沒有明顯的緩解作用。
在檸檬酸和EDTA的影響下,實(shí)驗(yàn)組吊蘭的POD活性表現(xiàn)為先顯著低于空白組(CK),后隨著檸檬酸和EDTA濃度的升高而有所上升,特別是EDTA調(diào)控下的吊蘭POD活性呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì),在EDTA濃度為7.5mmol/L時(shí)達(dá)到最大值111.833U·min-1·g-1,顯著高于不添加EDTA時(shí)的73.167U·min-1·g-1,活性提高了 52.846%。
實(shí)驗(yàn)組吊蘭的SOD活性雖然隨著檸檬酸和EDTA濃度的增加有一定的波動(dòng),但仍表現(xiàn)為低于空白組(CK),甚至高濃度處理組還低于未施加調(diào)節(jié)劑的組別。這是由于在受到脅迫時(shí),SOD的靈敏度較高,通常會(huì)首先發(fā)生變化[18]。且根據(jù)相關(guān)性分析的結(jié)果也不難看出,吊蘭的抗氧化酶活性對(duì)兩種螯合劑的敏感度依次為:SOD>POD>CAT。因此在高濃度銅的脅迫下,吊蘭的SOD活性整體上是受到抑制的,而且檸檬酸和EDTA對(duì)土壤中銅的活化可能還加重了這種抑制。
從以上分析可以得出,檸檬酸和EDTA對(duì)銅污染環(huán)境下吊蘭抗氧化酶活性的影響主要體現(xiàn)在有利于POD活性的提高,且EDTA效果較好。
表6 檸檬酸對(duì)吊蘭的丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響Table 6 Effects of CA on content of MDA and activities of antioxidant enzymes of C.comosum
表7 EDTA對(duì)吊蘭的丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響Table 7 Effects of EDTA on content of MDA and activities of antioxidant enzymes of C.comosum
(1)檸檬酸和EDTA對(duì)吊蘭富集量的影響與其對(duì)土壤中銅的活化能力呈顯著性正相關(guān)。檸檬酸對(duì)土壤銅有較強(qiáng)的活化作用,能夠有效提高吊蘭對(duì)銅的吸收,且在濃度為5mmol/L時(shí)效果最為明顯;而EDTA對(duì)吊蘭富集作用的影響相對(duì)較弱。
(2)檸檬酸本身對(duì)吊蘭生長(zhǎng)可能具有一定的促進(jìn)作用,但其通過提高吊蘭的銅富集量,間接抑制了吊蘭的生長(zhǎng),且這種抑制主要體現(xiàn)在形態(tài)學(xué)指標(biāo)和生物量上;EDTA對(duì)吊蘭生長(zhǎng)無顯著影響,對(duì)吊蘭葉片的POD活性卻有明顯的促進(jìn)作用。相比而言,檸檬酸對(duì)吊蘭生長(zhǎng)狀況的影響比EDTA大。
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