寧 宇 苗永美，2 李 季 婁群峰 翁益群 陳勁楓*

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095；2安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽(yáng) 233100；3美國(guó)威斯康星大學(xué)園藝系，威斯康星麥迪遜 53706）

黃瓜轉(zhuǎn)錄因子CsCBF3的克隆及表達(dá)分析

寧 宇1苗永美1，2李 季1婁群峰1翁益群3陳勁楓1*

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095；2安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽(yáng) 233100；3美國(guó)威斯康星大學(xué)園藝系，威斯康星麥迪遜 53706）

利用RT-PCR技術(shù)從黃瓜中克隆了植物低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子C-repeat-Binding Factor3，將其命名為CsCBF3，GenBank登錄號(hào)為JQ900769。CsCBF3基因開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)為615 bp，編碼204個(gè)氨基酸。進(jìn)化樹(shù)分析表明，CsCBF3隸屬于CBF基因家族，與葡萄CBF3蛋白親緣關(guān)系最近，而與黑麥草、水稻CBF3蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，CsCBF3編碼的蛋白包含保守的AP2dNA結(jié)合域，N端的核定位信號(hào)區(qū)和C端的酸性氨基酸富集區(qū)，且該蛋白中的一些磷酸化位點(diǎn)及二級(jí)結(jié)構(gòu)在與DNA互作過(guò)程中發(fā)揮重要作用。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示低溫可誘導(dǎo)CsCBF3的表達(dá)，且其表達(dá)量在迅速達(dá)到峰值后又降低，說(shuō)明CsCBF3是一個(gè)快速響應(yīng)基因，推測(cè)其在黃瓜耐冷過(guò)程中起著重要的作用。

黃瓜；低溫；CBF3；基因克?。槐磉_(dá)分析

黃瓜（Cucumis sativus L.）屬葫蘆科甜瓜屬，是一種深受大眾喜愛(ài)的世界性蔬菜。黃瓜原產(chǎn)于喜馬拉雅山南麓的印度北部地區(qū)（陳勁楓，2008），喜溫暖濕潤(rùn)的氣候，低溫會(huì)使黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)下降，最終造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此，提高黃瓜耐冷性具有非常重要的實(shí)踐意義。目前的研究多利用一氧化氮、多胺、水楊酸等外源物質(zhì)來(lái)提高黃瓜在低溫環(huán)境下的適應(yīng)能力（徐洪雷和于廣建，2007；Zhang et al.，2009；王磊 等，2010），而有關(guān)黃瓜耐冷分子調(diào)控機(jī)理的報(bào)道則較少。

CBF3（C-repeat-Binding Factors）屬于 A P2/EREBP（Ethylene-responsive element binding protein）基因家族，是一種受低溫特異誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，可激活下游多個(gè)效應(yīng)基因表達(dá)，從而提高植物對(duì)低溫、干旱等多種逆境脅迫的抗性（Yang et al.，2005）。該轉(zhuǎn)錄因子首先在對(duì)擬南芥的研究中被發(fā)現(xiàn)（Yamaguchi-Shinozaki & Shinozaki ，1994），隨后在油菜（Jaglo et al.，2001）、水稻（Dubouzet et al.，2003）等作物上也分離克隆出了CBF3基因，且證明其可被低溫環(huán)境所誘導(dǎo)。由于CBF3可調(diào)控多個(gè)相關(guān)基因來(lái)提高植物的抗性，因此克隆CBF3基因和利用基因工程技術(shù)為改良植物耐冷品質(zhì)提供了更好的選擇，目前已有研究表明CBF3可顯著提高轉(zhuǎn)基因植株如高羊茅（Zhao et al.，2007）、黑麥草（Li et al.，2011）、煙草（Yang et al.，2011）等作物的耐冷性。而在黃瓜中，該基因的功能和分子作用機(jī)制還尚未明確。

本試驗(yàn)從黃瓜耐冷品種Chipper中克隆到了黃瓜CBF3基因，對(duì)其編碼的氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為明確基因功能奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)利用熒光定量技術(shù)研究了低溫脅迫與黃瓜CBF3表達(dá)量之間的關(guān)系，以期從一定程度上揭示黃瓜耐冷的 分子調(diào)控機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

以南京農(nóng)業(yè)大學(xué)葫蘆科作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室保存的美國(guó)生態(tài)型黃瓜Chipper為試材。試驗(yàn)于2011年秋季在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行，選取飽滿的種子浸種催芽，將露白的種子播于育苗穴盤(pán)中，在晝溫25℃，夜溫18℃，光照12 h的人工氣候箱中培養(yǎng)。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至2～3片真葉時(shí)，將幼苗放置于4℃的人工氣候箱中，分別于處理0、2、4、8、12、24 h后取幼嫩葉片，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA、RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 黃瓜DNA的提取采用SDS-CTAB法（江彪，2011）。按Trizol法提取總RNA，并參照TAKARA公司的DNase I試劑盒說(shuō)明消除微量DNA污染。取純化后的總RNA用于cDNA第一鏈的合成（PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit，TAKARA）。

1.2.2 CsCBF3基因的克隆 以擬南芥CBF3基因（AEE85065）的核酸序列為信息探針，在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/index.jsp）中進(jìn)行Blast同源搜索，找到黃瓜CBF3基因。根據(jù)開(kāi)放閱讀框的上下游末端設(shè)計(jì)引物，引物序列CBF3-F:5′-ATGTCTTCTTCGTCTTCAAGCT-3′；CBF3-R:5'-TCACTCATGACTCCATAACGAC-3′。 引 物委托上海英駿生物科技公司合成。

分別以基因組DNA和cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃7min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，按凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收目的片段，并將其克隆在pMD19-T載體上。熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑經(jīng)Amp抗性篩選和菌液PCR檢測(cè)鑒定過(guò)的陽(yáng)性克隆送交南京金斯瑞公司測(cè)序。

1.2.3 CsCBF3蛋白的生物信息學(xué)分析 利用DNAman6.0軟件對(duì)CsCBF3編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和分析。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)由MEGA5.0構(gòu)建，采用鄰接法（Neighbor Joiningmethod）作圖，重復(fù)計(jì)算次數(shù)設(shè)為1000。分別使用Expasy蛋白質(zhì)組分析工具中的ProtParam軟件（http://web.expasy.org/protpara）和 COR軟件（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。蛋白質(zhì)翻譯后修飾的磷酸化位點(diǎn)分析采用在線軟件Netphos2.0 Server完成（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）。利用在線工具Smart分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（http://smart.embl-heidelberg.de/）。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CsCBF3基因的表達(dá) 提取低溫脅迫下不同時(shí)間段內(nèi)（0、2、4、8、12、24 h）的黃瓜葉片的總RNA，經(jīng)DNase I消化后反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈，取適量作為模板。

根據(jù)已獲得的CsCBF3的開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR引物，引物序列qCBF3-F:5'-CTCAACCAACGACCACCT-3'；qCBF3-R:5'- CGCAAACCCATTTACCAT-3′， 擴(kuò) 增 片 段長(zhǎng)度為128 bp。選取黃瓜看家基因EF1a作為內(nèi)參，引物序列EF1a-F:5'-ACTGTGCTGTCCTCATTATTG-3′；EF1a-R:5'- AGGGTGAAAGCAAGAAGAGC-3′。

試驗(yàn)在Bio-Rad iCycler iQ實(shí)時(shí)定量PCR 儀上進(jìn)行，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。反應(yīng)采用20 μL體系，包括1μL cDNA，上、下游引物各1μL，10μL iQTMSYBR?green Supermix（Bio-Rad），7μLddH2O。兩步法擴(kuò)增，具體程序?yàn)?95℃預(yù)變性2min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)行融解曲線分析。

將正常條件下CsCBF3的表達(dá)量設(shè)為1，按照2-ΔΔCT法計(jì)算出基因的相對(duì)表達(dá)量，采用Excel軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsCBF3基因的克隆

以cDNA第一鏈為模板，用引物CBF3-F/CBF3-R擴(kuò)增出了615 bp左右的目的片段（圖1）。測(cè)序結(jié)果顯示該片段與黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中目的基因核酸序列的一致性為100%，表明已成功克隆到黃瓜CBF3基因，命名為CsCBF3，GenBank登錄號(hào)為JQ900769。與黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)CsCBF3基因沒(méi)有內(nèi)含子；以黃瓜基因組DNA為模板也可擴(kuò)增出同樣大小的片段（圖1），再次證明了該基因不含有內(nèi)含子，這與已報(bào)道的擬南芥CBF3基因的結(jié)構(gòu)特征相一致（Gilmour et al.，1998）。

2.2 CsCBF3氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析

圖1 瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

利用DNAman6.0對(duì)CsCBF3編碼的氨基酸序列與其他物種的CBF3氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析。比對(duì)結(jié)果顯示，黃瓜CBF3氨基酸序列與擬南芥（ABV27154）的相似性最高，達(dá)到43.70%，其次是葡萄（ACT45468）和辣椒（ADM73296），分別為41.84%、36.52%，而與茄子（AAS77819）、蒺藜苜蓿（ABG75914）、黑麥草（AAX57275）、水稻（AEW67332）、大麥（ABE02655）、玉米（NP001105651）和大豆（ACA63936）等物種的CBF3蛋白相似性較低（圖2）。由MEGA5.0構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明黃瓜CBF3與葡萄CBF3的親緣關(guān)系最近，在進(jìn)化上屬同一分支，而與水稻、黑麥草的CBF3蛋白的親緣關(guān)系則較遠(yuǎn)（圖3）。

圖2 CsCBF3與其他物種CBF3蛋白氨基酸序列的同源性比對(duì)

圖3 黃瓜及其他物種CBF3蛋白進(jìn)化樹(shù)分析

2.3 CsCBF3蛋白結(jié)構(gòu)與功能分析

CsCBF3基因編碼的多肽鏈包含204個(gè)氨基酸殘基，等電點(diǎn)（PI）為8.42，不穩(wěn)定系數(shù)為64.86，較高，符合其轉(zhuǎn)錄因子的特性。大量研究報(bào)道表明，轉(zhuǎn)錄因子的功能活性受到磷酸化修飾的調(diào)控（Ciceri et al.，1997），因此本試驗(yàn)對(duì)CsCBF3蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。如圖4所示，分值大于0.5的磷酸化位點(diǎn)有:絲氨酸磷酸化位點(diǎn)12個(gè)，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)2 個(gè)，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)1個(gè)，這些磷酸化位點(diǎn)大部分集中于氨基酸序列100～150范圍內(nèi)（圖4）。

圖4 CsCBF3蛋白序列磷酸化位點(diǎn)分析

在蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)上，CsCBF3基因編碼的肽鏈具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即N端信號(hào)區(qū)域（第1～35位）、AP2/EREBPdNA結(jié)合域（第36～98位）和C端酸性激活區(qū)域（第99～204位）。其中在第20～32位序列區(qū)段內(nèi)富含多個(gè)堿性氨基酸（精氨酸R和賴氨酸K），為該轉(zhuǎn)錄因子的核定位信號(hào)區(qū)NLS（圖2），轉(zhuǎn)錄因子CsCBF3進(jìn)入細(xì)胞核的過(guò)程受到該區(qū)域的調(diào)控。在AP2dNA結(jié)合域內(nèi)存在著3個(gè)β折疊和1個(gè)α螺旋（圖5），這些結(jié)構(gòu)在參與識(shí)別各類順式作用元件及同轉(zhuǎn)錄因子或DNA的相互作用中起關(guān)鍵作用（Allen et al.，1998；Kanaya et al.，1999）。

圖5 CsCBF3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.4 CsCBF3基因在不同逆境脅迫下的表達(dá)分析

利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了CsCBF3在低溫脅迫下表達(dá)量的變化情況，結(jié)果表明（圖6），CsCBF3在低溫處理后的表達(dá)量顯著高于處理前，證明低溫可誘導(dǎo)CsCBF3的表達(dá)。當(dāng)黃瓜受到低溫脅迫后，CsCBF3的表達(dá)量迅速增加并在2 h時(shí)達(dá)到峰值，約為對(duì)照的56倍，在隨后4～8 h內(nèi)表達(dá)量下降，而后又有所上升。這種變化規(guī)律說(shuō)明CsCBF3可能在快速提高黃瓜對(duì)低溫脅迫抵抗能力的過(guò)程中起著非常重要的作用。

圖6 熒光定量PCR檢測(cè)CsCBF3在低溫脅迫下的表達(dá)

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)RT-PCR技術(shù)首次克隆到了黃瓜CBF3基因（JQ900769），并從生物信息學(xué)的角度對(duì)其編碼的氨基酸序列進(jìn)行了分析，為該基因的功能鑒定奠定了基礎(chǔ)。CsCBF3蛋白不穩(wěn)定系數(shù)高，不含跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽，推測(cè)其可能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的作用。CsCBF3蛋白具有12個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，說(shuō)明其可能在翻譯后通過(guò)磷酸化和去磷酸化修飾而完成該轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的過(guò)程（Medina et al.，1999），其中第37位的酪氨酸、第67位的絲氨酸位于AP2基因家族保守的AP2/EREBPdNA結(jié)合域內(nèi)，因此可推斷這兩個(gè)氨基酸殘基在蛋白與DNA結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用。同源比對(duì)結(jié)果顯示，CsCBF3與擬南芥CBF3相似度較高，表明其可能具有相同的分子生物學(xué)作用，但還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

轉(zhuǎn)錄因子CBF3在植物低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)?shù)蜏孛{迫發(fā)生時(shí)，CBF3基因被誘導(dǎo)激活，與CRT/DRE順式作用元件特異結(jié)合，激活下游多個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域含有該元件的效應(yīng)基因表達(dá)，從而提高植物對(duì)低溫及其他脅迫的抵抗能力（Liu et al.，1998；Fowler & Thomashow，2002；Gilmour et al.，2004）。水稻上的研究表明，CBF3是一個(gè)快速響應(yīng)基因，可在短時(shí)間內(nèi)提高植株的耐冷性，當(dāng)脅迫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，CBF3的表達(dá)量會(huì)因受到MYBS3基因的抑制而降低，同時(shí)MYBS3表達(dá)量逐漸升高，提高了水稻對(duì)長(zhǎng)期低溫環(huán)境的耐受性（Su et al.，2010）。本試驗(yàn)中熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，CsCBF3的表達(dá)量一般在脅迫2 h后就達(dá)到峰值，證明其是一個(gè)快速響應(yīng)基因。隨后其表達(dá)量先是降低，而后又有所升高，這與水稻CBF3基因的表達(dá)模式略有不同，推測(cè)在黃瓜中可能并不存在一個(gè)特異的基因?qū)ｉT(mén)負(fù)責(zé)調(diào)控長(zhǎng)時(shí)間的低溫脅迫，而是由CsCBF3在整個(gè)脅迫過(guò)程中發(fā)揮作用。

此外，筆者還成功構(gòu)建了由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體pCAMBIA1304-CsCBF3，對(duì)黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化工作正在進(jìn)行中，以期能進(jìn)一步對(duì)CsCBF3的功能進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)也希望能夠獲得對(duì)低溫有較高耐受性的轉(zhuǎn)基因黃瓜植株，為黃瓜耐冷育種提供新的種質(zhì)資源材料。

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Cloning and Expression Analysis of Transcription Factor CsCBF3gene from Cucumber

NING Yu1，MIAO Yong-mei1，2，LI Ji1，LOU Qun-feng1，WENG Yi-qun3，CHEN Jin-feng1*
（1State Key Laboratory of Cropgenetics andgermplasm Enhancement，College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing210095，Jiangsu，China；2College of Life Science，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang233100，Anhui，China；3Horticulturedepartment，University of Wisconsin，Madison53706，USA）

In order todetermine its role in cold response in cucumber （Cucumis sativus L.），CsCBF3 was cloned from Chipper using RT-PCRmethod and itsgenBank accession number was JQ900769.CsCBF3 had an open reading frame of615 bp，which was supposed to encode a protein of204 amino acids.Phylogenetic tree analyses showed that CsCBF3 belonged to CBFgene family and had close relationship with CBF3 from Vitis amurensis，while had far relationship with CBF3 fromLolium perenne and Oryza sativa.Bioinformatics analysis showed that CsCBF3 protein was consisted of AP2dNA bindingdomain，which included amino acid residues，nuclear localization signal region and acidic activationdomain，and some phosphorylation sites and protein secondary structuresmay play important roles in process of interactions between proteins anddNA.Quantitative real-time PCR results showed that expression of CsCBF3 could be induced by low temperature，and the level reached to peak very fast and thendecreased.These results suggested that CsCBF3 was a rapid responsegene and played an important role in resistance to low temperature in cucumber.

Cucumber；Low temperature；CBF3；GenECloning；Expressive analysis

S642.2

A章編號(hào):1000-6346（2013）06-0030-07

2012-09-17；接受日期:2012-11-23

國(guó)家“973”計(jì)劃項(xiàng)目（2009CB119001），國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（30830079），江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目（CX（11）1002）

寧宇，男，碩士研究生，專業(yè)方向:蔬菜生物技術(shù)，E-mail:2010104050@njau.edu.cn

*通訊作者（Corresponding author）:陳勁楓，男，教授，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向:蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)，E-mail:jfchen@njau.edu.cn