王宇婷， 易有金，2，3＊， 夏 菠， 楊建奎， 曾 靜

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，長沙 410128；2.湖南省食品科學與生物技術(shù)重點實驗室，長沙 410128；3.湖南省發(fā)酵工程技術(shù)中心，長沙 410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學理學院，長沙 410128；

5.湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，長沙 410128）

植物內(nèi)生菌是一類寄生于健康植物組織內(nèi)的微生物類群，至今被研究過的不到15%［1］。近幾年的研究表明，植物內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物中許多具有抗菌活性。Arunachalam等［2］從穿心蓮健康葉中分離出20株內(nèi)生細菌，8株具有抗菌活性；Gayathri等［3］從5種紅樹屬植物葉中分離到的104株內(nèi)生細菌中36株具有生物活性，而其中28株具有抗菌活性。80%的內(nèi)生真菌具有抗真菌、抗雜草或抗藻類活性，而來自土壤中的真菌大約只有43%具有抗菌活性［4］。許多內(nèi)生菌抗菌活性物質(zhì)是未開發(fā)的新物質(zhì)［4］，據(jù)統(tǒng)計，植物內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)新化合物的比例為51%，而土壤微生物僅有38%［5］。隨著病原菌耐藥性的出現(xiàn)，人們渴望開發(fā)出新的抗菌藥物。對內(nèi)生菌這一抗菌活性物質(zhì)來源新領域的研究將具有十分重大的意義。

從煙草植物組織中分離得到一株內(nèi)生拮抗細菌011，經(jīng)鑒定其為短短芽胞桿菌［Brevibacillus brevis（Migula）Shida et al.］，GenBank登錄號為DQ444285［6］。前期研究結(jié)果表明，011菌對煙草青枯病具有良好的防治效果，室內(nèi)和田間防治效果分別達到87.25%和82.23%［6］。為進一步明確該菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)，并擴大其在生物防治上的應用，本研究對011菌發(fā)酵濾液抑菌譜進行測定，并顯微觀察其對番茄早疫病菌菌絲及孢子抑制作用。011菌發(fā)酵濾液對番茄早疫病菌最低抑菌濃度、有效中濃度及其抗菌活性穩(wěn)定性的測定，為開發(fā)新型生物防治劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

內(nèi)生短短芽胞桿菌011菌株由湖南省食品科學與生物技術(shù)重點實驗室分離、鑒定與保存。番茄早疫病菌［Alternaria solani （Ellis et Martin）Sorauer］、白菜黑斑病菌［A.brassicae （Berk.）Sacc.］、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorumLib.）、黃瓜炭疽病菌［Colletotrichum lagenarium （Pass.）Ell.and Halst.］、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici Leonlan）、辣椒炭疽病菌［Colletotrichum capsici （Syd.）Butl.et Bisby］、柑 橘 炭 疽 病 菌 ［Colletotrichum gloeosporioides （Penz.）Sacc.］、黃 瓜 枯 萎 病 菌（Fusarium oxysporumSchl.），供試病原菌株均由湖南農(nóng)業(yè)大學植物病理實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

BPY液體培養(yǎng)基、PDA固體培養(yǎng)基［7］。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生短短芽胞桿菌011菌發(fā)酵濾液制備

種子液制備：將斜面保存的011菌株接入BPY培養(yǎng)液中，裝液量100mL／250mL、初始pH7.0、30℃、180r／min振蕩培養(yǎng)24h。

發(fā)酵培養(yǎng)：以1%接種量將種子液接種到BPY發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量100mL／250mL、初始pH7.0、30℃、180r／min振蕩培養(yǎng)48h。

發(fā)酵液處理：011菌液體培養(yǎng)物于10000r／min離心10min，上清液經(jīng)孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾，得到含有抑菌活性物質(zhì)的發(fā)酵濾液。

1.2.2 平皿打孔法檢測抗菌活性

將病原真菌接種于PDA固體培養(yǎng)基中央，28℃下培養(yǎng)24h后在新長成的菌絲周圍打孔（d＝6mm），將待測活性物質(zhì)注入孔內(nèi)，每孔100μL，用未接菌的BPY液體培養(yǎng)基作空白對照，28℃培養(yǎng)48h，觀察抑菌狀況及抑菌帶寬度［8］。

1.2.3 抗菌譜測定

采用平皿打孔法測定011菌發(fā)酵濾液對8種植物病原真菌的抑菌作用，以未接菌的BPY液體培養(yǎng)基作對照，每處理3次重復。

1.2.4 011菌發(fā)酵濾液對番茄早疫病菌菌絲的影響

挑取平皿打孔法抗菌活性測定中抑菌帶邊緣的番茄早疫病菌菌絲，鏡檢觀察菌絲形態(tài)［9］，每處理3次重復。

1.2.5 011菌發(fā)酵濾液對番茄早疫病菌孢子萌發(fā)的影響

將番茄早疫病菌于PDA上培養(yǎng)一定時間后使其產(chǎn)孢，用少量無菌水將病菌孢子洗下來，加無菌水稀釋到40倍物鏡下每視野中40個孢子。取上述配制的孢子懸浮液加入等體積011菌發(fā)酵濾液混均，以加無菌水為對照，取10μL滴加于凹玻片上。28℃保濕培養(yǎng)24h，顯微鏡下取中間及四周5個視野觀察孢子形態(tài)，并記錄每個視野中孢子總數(shù)及萌發(fā)數(shù)。孢子芽管長度大于孢子直徑視為萌發(fā)。

1.2.6 MIC及EC50測定

取不同濃度011菌發(fā)酵濾液100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%，加入等體積番茄早疫病菌孢子懸浮液，使011菌發(fā)酵濾液終濃度為50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%，按1.2.5觀察孢子萌發(fā)情況，每處理3次重復。計算孢子萌發(fā)抑制率，求出最低抑菌濃度MIC。在MIC之下，將抑菌的百分率轉(zhuǎn)換成幾率值，濃度轉(zhuǎn)換成對數(shù)，通過回歸分析求得抑制萌發(fā)的有效中濃度（EC50）。

1.2.7 011菌發(fā)酵濾液抗菌活性穩(wěn)定性測定

熱穩(wěn)定性：將011菌發(fā)酵濾液分別于60、70、80、90、100℃水浴中保溫1h，以未經(jīng)處理的發(fā)酵濾液為對照。酸堿穩(wěn)定性：用0.1mol／L的 HCl及0.1mol／L的NaOH溶液將011菌發(fā)酵濾液分別調(diào)pH 至2.0、4.0、6.0、7.0、8.0、10.0，室溫放置12h，將pH調(diào)回7.0定容至相同體積。紫外光穩(wěn)定性：將發(fā)酵濾液于20W紫外燈下分別照射（照射距離30cm）30、60、90、120min，以未經(jīng)紫外光照射的發(fā)酵濾液作對照，每處理3次重復。以番茄早疫病菌為指示菌，按1.2.2方法檢測抗菌活性。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

采用SAS軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析（Duncan多重比較分析差異性顯著性法P＝0.05）?；貧w分析由Microsoft Excel完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌譜

011菌發(fā)酵濾液抗菌譜顯示，該菌株發(fā)酵濾液對多種植物病原真菌具有抑制作用，抑菌帶寬度見表1，011菌株發(fā)酵濾液對番茄早疫病菌抑菌帶寬度最大（圖1），為5.5mm，拮抗能力最強；對柑橘炭疽病菌抑菌帶寬度最小（圖2），為2.1mm，拮抗能力最弱。

表1 011菌株發(fā)酵液對植物病原真菌的拮抗作用Table 1 Antibiotic effects of the ferments of the strain 011 on plant fungal pathogens

圖1 011菌株對番茄早疫病菌的抑制作用Fig.1 The inhibition zone of the strain 011against A.solani

圖2 011菌株對柑橘炭疽病菌的抑制作用Fig.2 The inhibition zone of the strain 011 against Colletotrichum gloeosporioides

2.2 對番茄早疫病菌菌絲形態(tài)的影響

011菌發(fā)酵濾液對番茄早疫病菌菌絲生長及菌絲形態(tài)有明顯影響，在發(fā)酵濾液邊緣處，病原菌菌絲不能向外生長，形成一條抑菌條帶（圖1）。挑取抑菌帶邊緣的番茄早疫病菌菌絲鏡檢發(fā)現(xiàn)，番茄早疫病菌菌絲生長異常，菌絲細胞畸形，菌絲節(jié)間變短變粗，粗細不均勻，細胞原生質(zhì)收縮，出現(xiàn)空泡（如圖3a）。正常菌絲光滑，透明，粗細均勻，原生質(zhì)分布均勻（如圖3b）。

圖3 011菌株發(fā)酵液對番茄早疫病菌菌絲的作用（40×）Fig.3 Antagonism of the strain 011against the mycelia of A.solani

2.3 對番茄早疫病菌孢子萌發(fā)影響

采用孢子萌發(fā)法，將番茄早疫病菌孢子懸浮液培養(yǎng)24h后，40×顯微鏡下觀察，對照組孢子形成細長、光滑、均勻的芽管（圖4c）。高濃度011菌發(fā)酵濾液使孢子發(fā)芽點處出現(xiàn)囊泡（圖4a），從而完全抑制孢子萌發(fā)。低濃度011菌發(fā)酵濾液使芽管畸形，中間或頂端膨大，或成串珠狀（圖4b），而且受抑制的孢子芽管長度明顯也小于對照組。

圖4 011菌株發(fā)酵液對番茄早疫病菌孢子萌發(fā)影響（40×）Fig.4 Effects of the ferment of the strain 011on spore germination of A.solani（40×）

2.4 MIC及EC50

由表1可知，經(jīng)不同濃度011菌發(fā)酵濾液處理后，番茄早疫病菌孢子萌發(fā)均受到不同程度抑制。當濃度大于30%時，孢子萌發(fā)完全被抑制，即011菌發(fā)酵濾液對番茄早疫病菌孢子萌發(fā)MIC為30%。當發(fā)酵濾液濃度小于30%時，不同處理間的孢子萌發(fā)抑制率表現(xiàn)出顯著差異（表2），通過回歸分析所得毒力方程：Y＝3.4263 X＋8.4459，相關系數(shù)R＝0.9992；經(jīng)計算知其抑制番茄早疫病菌孢子萌發(fā)有效中濃度EC50為9.87%。

表2 011菌株發(fā)酵液對番茄早疫病菌孢子萌發(fā)抑制作用Table 2 Inhibition of A.solani spore germination by the ferment of the strain 011

2.5 011菌發(fā)酵濾液活性穩(wěn)定性

由圖5可知，溫度對發(fā)酵濾液抑菌活性影響不大。100℃處理1h抑菌帶寬度為5.28mm，為對照（未處理的發(fā)酵濾液）抑菌帶寬度5.53mm的95.48%，表明發(fā)酵濾液中抗菌活性物質(zhì)對高溫具有較好的耐受性。

由圖6可知，發(fā)酵濾液在酸性條件下有較好的穩(wěn)定性，pH2.0抑菌帶寬度與pH7.0沒有明顯差異，說明酸性條件對抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性沒有影響。但發(fā)酵濾液對堿不穩(wěn)定，pH7.0抑菌帶寬度5.30mm，隨著pH的升高抗菌活性顯著降低，pH8.0抑菌帶寬度為4.61mm，pH10.0抑菌帶寬度降為2.71mm。

經(jīng)紫外光照射不同時間后，結(jié)果見圖7，其抑菌帶寬度與對照（未處理發(fā)酵濾液）相比無明顯變化，說明該發(fā)酵濾液對紫外光不敏感。

圖7 不同紫外光照射時間對發(fā)酵濾液活性的影響Fig.7 Effects of different UV exposure times on the activity of the culture filtrates of the strain 011

3 討論

植物內(nèi)生菌因其在植物體內(nèi)占據(jù)有利生態(tài)位點而定殖、誘導植物產(chǎn)生抗性、與植物形成協(xié)同關系、產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)［10］，是一種較為理想的生防微生物，內(nèi)生菌用于田間防治及果蔬保鮮已有報道［11－14］。本試驗研究了植物內(nèi)生菌011菌發(fā)酵濾液的抑菌活性，表明011菌株產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)抑制植物病原菌生長是其作為生防菌的一重要作用機理。抑菌譜測試其對白菜黑斑病菌、油菜菌核病菌、黃瓜炭疽病菌、辣椒疫病菌、辣椒炭疽病菌、柑橘炭疽病菌、黃瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌多種植物病原菌均有抑制效果，011菌發(fā)酵濾液有望開發(fā)成生物農(nóng)藥來防治農(nóng)作物病原真菌。但本試驗還沒解決是什么物質(zhì)起抗菌作用，因此對該菌株發(fā)酵濾液的成分還有待深入探索。到目前為止，已有大量研究報道內(nèi)生菌產(chǎn)生種類繁多的抗菌活性物質(zhì)，如生物堿、抗菌肽、酚類、萜類、醌類、幾丁質(zhì)酶及揮發(fā)性物質(zhì)等［15］。

顯微觀察011菌發(fā)酵濾液對番茄早疫病菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其使番茄早疫病菌菌絲節(jié)間變短變粗，扭曲變形，細胞原生質(zhì)收縮，出現(xiàn)空泡，使菌絲不能正常生長。這可能是由于活性物質(zhì)作用于病原菌的細胞膜，造成細胞膜破裂而引起的，有此類現(xiàn)象的抗生素很多，研究清楚的為多烯類抗生素。多烯類抗生素通過與質(zhì)膜中含有的麥角醇作用損傷細胞質(zhì)膜造成細胞內(nèi)物質(zhì)泄漏［16］。高濃度發(fā)酵濾液使番茄早疫病菌孢子出芽點處產(chǎn)生囊泡，而完全抑制芽管生長，低濃度發(fā)酵濾液使芽管膨大，而不能正常生長，這與王艷紅等［17］報道溫郁金內(nèi)生真菌L18對玉米彎孢葉斑病菌孢子萌發(fā)的作用一致。微生物通過分泌一種或多種抗菌物質(zhì)，作用于病原菌的細胞壁、細胞膜、蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)、能量代謝系統(tǒng)、細胞分裂等，可直接抑制或殺死病原菌［18］。有報道殺稻瘟菌素－S通過抑制孢子和菌絲的呼吸作用而強烈抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長［19］。但011菌發(fā)酵濾液的作用位點還有待進一步研究。

拮抗菌制劑的效果與拮抗菌制劑的發(fā)酵工藝、制備方法等有著密切的關系［20］。測定011菌發(fā)酵濾液對番茄早疫病菌孢子萌發(fā)最低抑菌濃度MIC為30%、有效中濃度EC50為9.87%；穩(wěn)定性測定表明011菌株產(chǎn)生的具有抗菌活性次生代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)在高溫及酸性環(huán)境下穩(wěn)定，在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，且其結(jié)構(gòu)對紫外線不敏感，這為拮抗菌制劑開發(fā)及制備提供依據(jù)。

［1］ 江軍山，張鑫.產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)植物內(nèi)生菌的研究進展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（22）：11704－11705.

［2］ Arunachalam C，Gayathri P.Studies on bioprospecting of endophytic bacteria from the medicinal plant of Andrographis paniculatafor their antimicrobial activity and antibiotic susceptibility pattern［J］.International Journal of Current Pharmaceutical Research，2010，2（4）：63－68.

［3］ Gayathri S，Saravanan D，Radhakrishnan M，et al.Bioprospecting potential of fast growing endophytic bacteria from leaves of mangrove and salt－marsh plant species［J］.Indian Journal of Biotechnology，2010，9：397－402.

［4］ Schulz B，Boyle C，Draeger S.Endophytic fungi：a source of novel biologically active secondary metabolites［J］.Mycological Research，2002，106（9）：996－1004.

［5］ 吳芳婷，陳代杰，錢秀萍.植物內(nèi)生菌生物活性物質(zhì)研究新進展［J］.中國抗生素雜志，2004，29（3）：184－192.

［6］ 易有金，尹華群，羅寬，等.煙草內(nèi)生短短芽孢桿菌的分離鑒定及對煙草青枯病的防效［J］.植物病理學報，2007，37（3）：301－306.

［7］ 方中達.植病研究方法［M］.第3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

［8］ 易有金，劉如石，尹華群，等.煙草青枯病拮抗內(nèi)生細菌的分離、鑒定及其田間防效［J］.應用生態(tài)學報，2007，18（3）：554－558.

［9］ 王美琴，賀運春，劉慧平，等.內(nèi)生環(huán)狀芽孢桿菌Jcxy8對番茄灰霉病的防病機制研究［J］.中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報，2010，18（1）：98－101.

［10］賈栗，陳疏影，翟永功，等.近年國內(nèi)外植物內(nèi)生菌產(chǎn)生物活性物質(zhì)的研究進展［J］.中草藥，2007，38（11）：1750－1754.

［11］郭小英，劉慧平，韓巨才.植物內(nèi)生細菌LP5對黃瓜白粉病的田間防治效果［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，5（16）：3286－3287.

［12］林玲，金中時，馬長文，等.棉花黃萎病生防內(nèi)生細菌Jaas cd的鑒定及田間防效［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學報，2010，26（1）：65－69.

［13］吳士云，力軍，周聲，等.植物內(nèi)生多粘類芽孢菌對油桃采后青霉病 抑 制 效 果 的 研 究 ［J］.食 品 科 學，2007，28（11）：579－583.

［14］王蘭英，廖鳳仙，駱焱平.九里香內(nèi)生細菌HBS－1的鑒定及其對芒果采后病害的防效［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學報，2012，28（1）：41－45.

［15］Yu Hongsheng，Zhang Lei，Li Lin，et al.Recent developments and future prospects of antimicrobial metabolites produced by endophytes［J］.Microbiological Research，2010，165：437－449.

［16］蔣細良，謝德齡.農(nóng)用抗生素的作用機理［J］.生物防治通報，1994，10（2）：76－81.

［17］王艷紅，吳曉民，朱艷萍，等.溫郁金內(nèi)生真菌Chaetomium globosumL18對植物病原菌的抑菌譜及拮抗機理［J］.生態(tài)學報，2012，32（7）：2040－2046.

［18］江軍山，張鑫.產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)植物內(nèi)生菌的研究進展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（22）：11704－11705，11761.

［19］蔣細良，謝德齡，倪楚芳，等.中生菌素對真菌作用機理的研究［J］.中國生物防治，1997，13（2）：69－71.

［20］裘紀瑩，王未名，陳建愛，等.拮抗菌在果蔬保鮮中的應用研究進展［J］.食品工業(yè)科技，2009，30（5）：334－336.