李紅梅，孫 元，亓文寶，孟其麟，田大勇，廖 明，仇華吉*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室豬傳染病研究室，黑龍江哈爾濱150001；2.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室，廣東廣州510642)

腺病毒載體因具有宿主范圍廣泛、對人的致病力低、病毒粒子穩(wěn)定、基因組較少發(fā)生重排、易于DNA重組技術(shù)操作、具有高效遞送和表達外源基因等優(yōu)點，成為最常用的病毒載體之一。其中，人5型非復(fù)制性腺病毒載體因缺失病毒非必需基因區(qū)(E1/E3)，使其能夠攜帶大片段的外源基因，而又由于它是復(fù)制缺陷性的，僅發(fā)生一過性感染，安全性極高，所以被廣泛用于新型疫苗的研制。

近年來，RNA復(fù)制子載體由于具有表達效率高、安全性好等優(yōu)點得到高度關(guān)注。RNA復(fù)制子載體是在RNA病毒感染性克隆的基礎(chǔ)上用其它外源基因替換病毒所有結(jié)構(gòu)蛋白基因、保留其非結(jié)構(gòu)蛋白基因和非編碼區(qū)而構(gòu)建的表達系統(tǒng)，它利用正鏈RNA病毒的自主復(fù)制特性，轉(zhuǎn)染細胞后能夠在表達病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的同時高效表達外源蛋白[1]。RNA復(fù)制子疫苗具有很強的優(yōu)勢，如：有自主復(fù)制能力，病毒自身調(diào)節(jié)功能蛋白的表達不受細胞影響，病毒蛋白表達量高等優(yōu)點[2]。不足之處是RNA復(fù)制子載體由于基因組過大不能有效導(dǎo)入體內(nèi)。另外，黃病毒復(fù)制子載體通常不穩(wěn)定，導(dǎo)致攜帶的外源基因不能正確地表達，這主要由于黃病毒復(fù)制子載體蛋白對宿主菌具有一定的毒副作用[3]，日本腦炎病毒(JEV)復(fù)制子載體也存在這種不穩(wěn)定性[4-5]。為提高復(fù)制子載體的穩(wěn)定性，González等通過插入內(nèi)含子的方法獲得穩(wěn)定的傳染性胃腸炎病毒感染性全長cDNA克隆[6]；Yamshchikov等通過在病毒cDNA的易變區(qū)插入內(nèi)含子的方法增強了正鏈RNA病毒感染性克隆在大腸桿菌中的穩(wěn)定性[7]。

JEV編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM/M、E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。其中非結(jié)構(gòu)蛋白NS1為第一個被翻譯并且是最重要的非結(jié)構(gòu)蛋白。NS1蛋白雖然不能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，但能夠刺激機體產(chǎn)生免疫保護作用[8]。Xu等構(gòu)建了表達JEV NS1蛋白的重組偽狂犬病病毒，并利用小鼠模型進行免疫效力評價，結(jié)果顯示，該重組病毒誘導(dǎo)了針對JEV的特異性體液免疫和細胞免疫反應(yīng)，并對JEV的攻擊提供了保護[9]。這為利用JEV復(fù)制子載體構(gòu)建二價疫苗提供了依據(jù)。

本實驗室已經(jīng)構(gòu)建了腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體豬瘟疫苗rAdV-SFV-E2，動物實驗表明，rAdV-SFV-E2免疫豬可以產(chǎn)生豬瘟特異性抗體，并能夠抵抗豬瘟強毒的攻擊。這種新型嵌合載體豬瘟疫苗免疫效果接近于豬瘟兔化弱毒疫苗[10]。這種使用腺病毒遞送復(fù)制子的策略解決了RNA復(fù)制子疫苗難以進入細胞內(nèi)的難題，從而有效提高了復(fù)制子疫苗的免疫效力。因此，本研究采用人5型復(fù)制缺陷性腺病毒遞送JEV復(fù)制子載體，構(gòu)建JEV/腺病毒嵌合載體平臺，用以開發(fā)基于JEV高效進入細胞的新型RNA復(fù)制子疫苗。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒載體、菌株及細胞 含有綠色熒光蛋白(EGFP)基因的JEV復(fù)制子pOK-JEV-EGFP由華南農(nóng)業(yè)大學構(gòu)建[11]；腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV及含有腺病毒骨架載體的AdEasy-1感受態(tài)菌購自Stratagene公司；HEK293細胞由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；各種限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA純化試劑盒及病毒基因組提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；pCI質(zhì)粒購自Promega公司。

1.3 轉(zhuǎn)移載體pShuttle-CMV的改造 根據(jù)pShuttle-CMV載體序列設(shè)計合成一對5'端有9個堿基相同的引物P1、P2。

P1：5'-TCAGAATTCGGTACCCGGATCTGGGC GTGGTTAAG-3'(EcoRⅠ、KpnⅠ)；P2：5'-TCAGA ATTCGCGGCCGCACAGTATTACGCGCTATGAGTA ACA-3'(EcoRⅠ、NotⅠ)。

以pShuttle-CMV為模板，以PrimeSTARRHS DNA聚合酶進行PCR擴增，獲得6500bp的環(huán)狀質(zhì)粒(刪去CMV-MCS-SV40polyA)，經(jīng)DNA試劑盒純化后，加入DpnⅠ限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒模板，再經(jīng)DNA純化試劑盒純化，轉(zhuǎn)化DH5α，提取質(zhì)粒酶切鑒定，重組質(zhì)粒命名為pShuttle。

根據(jù)pShuttle PmeⅠ位點附近序列，設(shè)計合成一對引物P3/P4，上下游引物引入相同的酶切位點SwaⅠ，以將PmeⅠ突變?yōu)镾waⅠ，引物序列如下。

P3：5'-AATTTAAATGAATTCAATAGCTTGT-3'(Swa Ⅰ)；P4： 5'-TTCATTTAAATTCCCTCTCAAG TCT-3'(Swa Ⅰ)。

以質(zhì)粒pShuttle為模板，用PrimeSTARRHS DNA聚合酶進行PCR擴增，擴增片段為不含PmeⅠ位點的質(zhì)粒全長序列，純化PCR產(chǎn)物，用SwaⅠ處理后自連，挑選能夠被SwaⅠ酶切并且不能被PmeⅠ酶切的克隆，命名為pShuttle-SwaI。

1.4 pSh-JEV-EGFP穿梭載體的構(gòu)建 將質(zhì)粒pOK-JEV-EGFP用NotⅠ/KpnⅠ酶切，膠回收CMV至SV40polyA序列片段，插入pShuttle-SwaⅠ的NotⅠ和KpnⅠ之間，構(gòu)建pSh-JEV-EGFP。

1.5 內(nèi)含子序列的引入 為增加JEV復(fù)制子的穩(wěn)定性，利用細菌內(nèi)同源重組的方法引入質(zhì)粒pCI的內(nèi)含子序列(圖1)，引物序列如下(下劃線為同源臂序列)：

P5：5'-GGGCTATCAATATGCTGAAACGCGGCCTACCCCGCGTAAGTATCAAGGTTACAAG-3'；P6：5'-AACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATACTAGT C TGTGGAGAGAAAGGCAAAg-3'。

以pCI為模板擴增攜帶JEV載體同源序列的內(nèi)含子序列，將PCR產(chǎn)物與經(jīng)SpeⅠ線性化的質(zhì)粒pSh-JEV-EGFP共轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌，利用細菌內(nèi)的重組酶進行同源重組，提取質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，陽性重組質(zhì)粒命名為pSh-JEV-In-EGFP。

圖1 引入內(nèi)含子序列結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1Schematic diagram of insertion of the intron

1.6 腺粒pAdV-JEV-In-EGFP的構(gòu)建 將pSh-JEV-In-EGFP用SwaⅠ線性化，DNA純化試劑盒純化后電轉(zhuǎn)化至BJ5183感受態(tài)菌中進行同源重組。經(jīng)卡那霉素抗性篩選，提取重組腺粒用PacⅠ酶切鑒定，構(gòu)建重組腺粒pAdV-JEV-In-EGFP。

1.7 重組病毒的包裝 提取pAdV-JEV-In-EGFP經(jīng)PacⅠ線性化后純化，采用Lipofectam ine 2000轉(zhuǎn)染試劑按說明書以6μg DNA/孔的濃度轉(zhuǎn)染至六孔板中的HEK293單層細胞。

1.8 重組腺病毒的純化與鑒定 轉(zhuǎn)染后第8d收集培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，離心，收集第一代病毒培養(yǎng)液，-20℃保存。將第一代病毒接種至HEK293細胞單層中，連續(xù)傳代，觀察熒光表達及細胞病變(CPE)情況，當大量熒光表達并且細胞大量病變時，將2μL病毒液接毒至新鮮單層細胞中，觀察熒光表達情況，48h收集細胞提取細胞總DNA，以腺粒pAdV-JEV-In-EGFP為陽性對照，以正常HEK293細胞DNA作為陰性對照，采用相同的引物PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測。

1.9 RT-PCR 為驗證JEV復(fù)制子的自主復(fù)制能力，采用RT-PCR方法進行檢測，引物序列：PEGFP-F：5'-ACCACATGAAGCAGCACGACT-3'； PEGFP-R：5'-GACCTTGTACAGCTCGTCCAT-3'。提取感染rAdVJEV-In-EGFP 48h的HEK293病變細胞總RNA，采用上述引物進行RT-PCR反應(yīng)檢測負鏈RNA，以驗證該載體能否在細胞中自我復(fù)制。

2 結(jié) 果

2.1 pSh-JEV-In-EGFP的穩(wěn)定性 為了增強JEV復(fù)制子載體的穩(wěn)定性，本實驗引入內(nèi)含子序列，以阻止復(fù)制子蛋白在細菌中的表達。將pSh-JEV-In-EGFP在細菌中傳20代，經(jīng)BglⅡ、EcoRⅠ單酶切及BglⅡ與EcoRⅠ雙酶切鑒定，獲得與預(yù)期大小相符的片段(圖2)，表明其具有良好穩(wěn)定性。

圖2 pSh-JEV-In-EGFP細菌中傳至20代酶切鑒定Fig.2Restriction enzyme analysis of pSh-JEV-In-EGFP after 20passages in bacterial cells

2.2 重組病毒rAdV-JEV-In-EGFP的鑒定及EGFP在細胞中的表達檢測 將腺粒pAdV-JEV-In-EGFP轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，出現(xiàn)瞬時熒光表達，8d后未見CPE形成，盲傳至4代～5代，可以觀察細胞內(nèi)大量的熒光表達，而且出現(xiàn)CPE(細胞變圓、發(fā)亮、向周邊擴散)。

提取重組病毒感染HEK293細胞的總DNA，用PCR檢測到JEV與EGFP交界處的部分片段以及內(nèi)含子序列片段1.0kb和0.2kb(圖3)。此外，熒光顯微鏡下可以觀察到EGFP蛋白在rAdV-JEV-In-EGFP感染的HEK293細胞中大量表達(圖4)。

圖3 重組腺病毒rAdV-JEV-In-EGFP的RCR鑒定Fig.3Identification of rAdV-JEV-In-EGFP by PCR

圖4 EGFP在rAdV-JEV-In-EGFP感染HEK293細胞中的表達Fig.4Expression of the EGFP protein in HEK293cells infected with the recombinant adenovirus rAdV-JEV-In-EGFP

2.3 JEV復(fù)制子復(fù)制能力的鑒定 分別以上下游引物對重組病毒感染細胞的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。并以其為模板進行PCR擴增。電泳結(jié)果顯示，以上游或下游引物反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA均能夠擴增出500bp DNA片段，顯示重組病毒感染HEK293細胞的總RNA中同時存在JEV的正鏈(基因組RNA)和負鏈RNA。表明JEV復(fù)制子能夠自我復(fù)制(圖5)。

3 討 論

JEV復(fù)制子具有表達自身非結(jié)構(gòu)蛋白、同時表達外源蛋白的特點。JEV復(fù)制子編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的免疫保護作用與Fc片段依賴性有關(guān)，特異性抗體通過補體依賴的形式殺傷感染的靶細胞，在病毒感染過程中引起免疫應(yīng)答，對接種動物提供保護性免疫[12]。Chen等用其構(gòu)建的編碼NS1的重組質(zhì)粒免疫動物后不能產(chǎn)生中和性抗體，但產(chǎn)生的高滴度ELISA抗體可以識別JEV?？赡苓@種抗體不能抑制病毒吸附敏感細胞，但當其與病毒結(jié)合后有利于清除體內(nèi)的病毒[13]。JEV復(fù)制子載體插入外源基因并保留了JEV非結(jié)構(gòu)蛋白，在誘導(dǎo)針對外源蛋白的抗體的同時，也產(chǎn)生針對JEV的免疫應(yīng)答。

圖5 rAdV-JEV-In-EGFP感染細胞中JEV復(fù)制子負鏈RNA的RT-PCR檢測Fig.5Detection of JEV negative-strand replicon RNA in rAdV-JEV-In-EGFP-infected cells by RT-PCR

采用腺病毒遞送JEV復(fù)制子表達系統(tǒng)，充分利用復(fù)制子高效表達外源基因的優(yōu)點，又解決了核酸疫苗不容易導(dǎo)入動物體內(nèi)的問題。本實驗室前期構(gòu)建的用腺病毒遞送甲病毒復(fù)制子表達豬瘟病毒(CSFV)E2基因的新型豬瘟嵌合載體疫苗，獲得很好的免疫保護效果[8]，這為本研究提供了研究思路和依據(jù)。

在前期工作中，構(gòu)建了表達EGFP蛋白的腺病毒/JEV復(fù)制子載體嵌合病毒，但用其它基因(如CSFV E2基因或豬流感病毒HA基因)替換EGFP基因后，盡管采用不同改進措施，比如轉(zhuǎn)化過程中使用能容納大片段并且生長較慢的DH10B菌株，使用低溫、低轉(zhuǎn)速、低濃度抗生素篩選[14-15]，卻始終無法得到正確表達外源基因的嵌合載體克隆。這可能是由于黃病毒cDNA在大腸桿菌中的不穩(wěn)定性造成的。為此，本實驗采用在JEV復(fù)制子中引入內(nèi)含子的方法，避免表達對宿主菌有毒害作用的蛋白[16]，能夠使JEV復(fù)制子載體在大腸桿菌中穩(wěn)定增殖。

本研究構(gòu)建了含有可以自我復(fù)制的JEV復(fù)制子并且穩(wěn)定表達EGFP的重組腺病毒。目前國內(nèi)外關(guān)于以腺病毒遞送JEV復(fù)制子表達載體的研究未見報道，本研究首次對腺病毒/JEV復(fù)制子嵌合載體表達系統(tǒng)進行初步探索，證明了由腺病毒遞送JEV復(fù)制子表達系統(tǒng)的可行性，為進一步研發(fā)以腺病毒遞送JEV復(fù)制子為基礎(chǔ)的新型疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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