王光明 吳雪梅 王睿君 楊福偉 趙洪衛(wèi) 付雙林 (吉林大學第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長春 3002)

雖然膠質(zhì)瘤的發(fā)病率較低，但它存在著較高的病死率。目前常規(guī)的治療手段仍然是手術及術后輔以放、化療，但并不能完全去除或殺死顱內(nèi)的腫瘤細胞。因此，找到一種合理有效的治療藥物成為神經(jīng)外科醫(yī)生急需解決的問題〔1〕。布魯生是中藥馬錢子有效成分之一，具有鎮(zhèn)痛、免疫抑制、抗炎和抑制血小板聚集等多種藥理活性。近年來人們研究發(fā)現(xiàn)，布魯生具有明顯抑制胃癌、肺癌、前列腺癌生長的作用，并誘導其凋亡〔2，3〕。本實驗探討布魯生的抗膠質(zhì)瘤作用機制及環(huán)氧合酶(COX)-2表達的關系，為布魯生的臨床應用提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 布魯生購自美國Bellancom公司。DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Invitrogen公司。MTT為美國Sigma公司產(chǎn)品。吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)均購于碧云天公司。PI、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒為美國Sigma公司產(chǎn)品。抗BCL-2、BAX、COX-2鼠單抗IgG、辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔、抗鼠二抗均購自碧云天生物研究所。ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人膠質(zhì)瘤SHG-44細胞購自中科院上海細胞研究所，予含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在5%CO2飽和濕度的37℃孵箱中培養(yǎng)，細胞長滿后經(jīng)胰酶消化法傳代。

1.2.2 MTT法測細胞成長抑制率 取對數(shù)生長期的SHG-44細胞，消化、計數(shù)，調(diào)整密度為6×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl。每組分別設6個復孔，細胞貼壁生長18 h后，更換DMEM培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)12、24、48 h，實驗組加入含不同濃度布魯生的培養(yǎng)液，終濃度為0.125、0.25、0.5、1.0、1.5 mmol/L，對照組加入等量DMEM培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)12、24、48 h。每孔加入 MTT溶液(5 mg/ml)20 μl。4 h后吸取孔內(nèi)的培養(yǎng)液。加入DMSO后，振蕩10 min使其內(nèi)甲瓚充分溶解。在酶標儀上檢測各孔的吸光度(490 nm激發(fā)波長)值，重復檢測3次，取平均值。與對照組比較，計算各組細胞生長抑制率。生長抑制率(%)=(1－實驗組 OD值/對照組 OD值)×100%。

1.2.3 吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)染色觀察 取對數(shù)生長期的SHG-44細胞，消化、計數(shù)，調(diào)整密度為6×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl。每組分別設6個復孔，細胞貼壁生長18 h后，更換DMEM培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)24 h，實驗組加入含不同濃度布魯生的培養(yǎng)液，終濃度為0.25、0.5、1.0 mmol/L，對照組加入等量DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸凈DMEM培養(yǎng)液，50 μl PBS液洗一遍，再加入50 μl PBS液后，加入預配好的AO、EB(10 mg/ml)各1 μl，避光2 min 后，熒光顯微鏡下以藍色激發(fā)光觀察細胞形態(tài)及顏色并照相。

1.2.4 流式細胞儀分析細胞周期變化 取對數(shù)生長期SHG-44細胞，消化、計數(shù)，調(diào)整密度為2×105/ml，培養(yǎng)瓶每瓶接種細胞1 ml，37℃培養(yǎng)18 h后更換實驗用培養(yǎng)液。實驗組加入含0.25、0.5、1.0 mmol/L布魯生的培養(yǎng)液，對照組加入等量DMEM培養(yǎng)液，作用24 h后分別終止培養(yǎng)。用胰酶消化細胞，預冷PBS洗滌2遍，加入FITC標記的Annexin V(2 μl)，冰上溫育20 min，迅速加入PI(1 μg/ml)，于流式細胞儀 FACS Calibur(Becton Dickson，USA)上檢測細胞凋亡情況，Annexin V陰性/PI陰性為正常細胞;Annexin V陽性/PI陰性為早期凋亡細胞;Annexin V陽性/PI陽性為晚期凋亡細胞。

1.2.5 Western蛋白印跡法檢測細胞中BCL-2、BAX、COX-2的表達情況 取對數(shù)生長期SHG-44細胞，消化、計數(shù)，調(diào)整密度為106/ml，培養(yǎng)瓶每瓶接種細胞1 ml，37℃培養(yǎng)18 h后更換培養(yǎng)液。實驗組加入含0.25、0.5、1.0 μmol/L布魯生的培養(yǎng)液，對照組加入等量DMEM培養(yǎng)液，作用24 h后分別終止培養(yǎng)。用細胞刮刀刮取貼壁細胞，連同培養(yǎng)液一同離心收集細胞。蛋白抽提方法和Western蛋白印跡法參照碧云天公司說明書。使用BCA法測定蛋白濃度，β-actin作為參照。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，多組比較進行單因素方差分析，兩兩比較進行Student t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測細胞存活率 不同劑量(0.125、0.25、0.5、1.0、1.5 mmol/L)布魯生分別處理 SHG-44 細胞12、24、48 h 后，細胞存活率呈現(xiàn)時間依賴性和劑量依賴性地降低。0.5 mmol/L的布魯生對SHG-44細胞作用24 h的存活抑制率達到66.8%，說明SHG44細胞的生長能被布魯生有效的抑制。見圖1。

圖1 MTT顯示不同濃度/時間的布魯生對SHG-44細胞生長和增殖的影響

圖2 AO/EB染色顯示不同濃度的布魯生作用SHG-44細胞24 h

2.2 AO/EB染色和流式細胞術檢測細胞凋亡 實驗組與對照組經(jīng)AO/EB染色后均在電子熒光顯微鏡下經(jīng)BV濾片激發(fā)，可觀察到對照組核染色質(zhì)著綠色熒光并呈正常結(jié)構;實驗組出現(xiàn)凋亡細胞，早期凋亡細胞(VA)核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或圓珠狀;非凋亡的死亡細胞(NVN)核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構;晚期凋亡細胞(NVA)核染色質(zhì)為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀?？梢园l(fā)現(xiàn)布魯生呈劑量性的誘導SHG-44細胞的凋亡，見圖2。為進一步驗證上述結(jié)果，再采用流式細胞儀，Annexin V/PI雙染法檢測布魯生對A549細胞膜PS外翻情況及細胞膜完整情況，結(jié)果顯示經(jīng)不同濃度布魯生處理24 h后，SHG44細胞晚期凋亡呈現(xiàn)劑量依賴性地增強，見圖3。

2.3 布魯生對SHG-44細胞作用24 h后BCL-2、BAX、COX-2的表達情況 布魯生能劑量依賴性地降低SHG-44細胞抗凋亡蛋白BCL-2蛋白的表達，相應的劑量性地升高促凋亡BAX蛋白的表達。與此同時，布魯生還呈劑量性地降低SHG44細胞中COX-2蛋白的表達(圖4)。

圖3 流式細胞儀檢測不同濃度的布魯生作用SHG-44細胞24 h

圖4 Western印跡檢測不同濃度布魯生對SHG-44細胞的BCL-2、BAX、COX-2表達的影響

3 討論

布魯生是從中藥馬錢子中提取的吲哚型結(jié)構的生物堿，是馬錢子發(fā)揮藥效的主要成分之一。近年來，布魯生的抗腫瘤活性逐漸成為人們關注的焦點。有研究報道，布魯生能明顯抑制肝癌、肺癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞的生長〔4，5〕。本實驗結(jié)果顯示，布魯生在體外對SHG-44細胞的生長具有顯著的抑制作用，并與藥物濃度及作用時間明顯相關，顯示良好的時間/劑量效應關系，與文獻〔6〕報道一致。證實馬錢子堿可誘導SHG44細胞凋亡，且在一定范圍內(nèi)呈劑量效應關系，隨藥物作用濃度的增加，凋亡率也逐漸上升。為了進一步證實布魯生對膠質(zhì)瘤SHG44細胞凋亡的影響，本文通過Western印跡實驗發(fā)現(xiàn)布魯生可以明顯上調(diào)BAX蛋白的表達、下調(diào)BCL-2蛋白的表達，同時布魯生可以劑量性地升高COX-2蛋白的表達。綜上，本文從不同側(cè)面、不同水平證實布魯生通過細胞內(nèi)途徑誘導膠質(zhì)瘤細胞SHG44誘導凋亡。

COX-2在大多數(shù)正常組織中均不表達，而在多種腫瘤組織中呈高表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。COX-2主要通過促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、促進腫瘤血管形成、增強腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移和抑制免疫功能等機制導致或促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有文獻報道，特異性的COX-2抑制劑等非甾體抗炎藥如塞來昔布、尼美舒利、阿司匹林等具有明顯的抗腫瘤活性〔7〕。本實驗結(jié)果提示布魯生可能通過對COX-2蛋白表達的抑制而促進膠質(zhì)瘤細胞的凋亡，但對腫瘤的作用可能并不局限于對COX-2表達的抑制。

本實驗初步研究表明，馬錢子堿有明顯抑制膠質(zhì)瘤SHG44細胞生長的作用，并且該抑制作用可能是通過誘導細胞凋亡實現(xiàn)的。這為今后在臨床上應用馬錢子堿治療腫瘤提供了一定的實驗理論依據(jù)。但細胞凋亡的過程是復雜多途徑的，馬錢子堿誘導SHG-44細胞凋亡的可能途徑和相關基因尚需進一步研究。布魯生雖具有明顯的抗腫瘤效果，但同時應該注意其誘導細胞凋亡的用量較大，與實際布魯生的體內(nèi)用量可能有些偏差。在以后的研究中，以期發(fā)現(xiàn)毒性小、效果顯著的化合物〔8〕。

1 Ge PF，Ji XM，Ding YC.Celastrol causes apoptosis and cell cycle arrest in rat glioma cells〔J〕.Neurol Res，2010;32(1):94-100.

2 王海麗，魏 武，紀愛芳.馬錢子堿對人白血病細胞株K562細胞的誘導凋亡作用〔J〕.中國實驗血液學雜志，2011;19(3):630-3.

3 Gong Z，Sun LR，Cao X.Strychnos alkaloids inhibit the proliferation of adult rat neuroprogenitor cells〔J〕.Food Chem Toxicol，2009;47(2):283-8.

4 Lazareno S，Gharagozloo P，Kuonen D，et al.Subtype-selective positive cooperative interactions between brucine analogues and acetylcholine at muscarinic receptors:radio ligand binding studies〔J〕.Mol Pharmacol，1998;53(3):573-9.

5 Deng X，Yin F，Lu X，et al.The apoptotic effect of brucine from the seed of strychnos nux-vomica on human hepatoma cells is mediated via Bcl-2 and Ca2+involved mitochondrial pathway〔J〕.Toxicol Sci，2006;91(1):59-69.

6 Rao PS，Ramanadham M，Prasad MN.Anti-proliferative and cytotoxic effects of strychnos nux-vomica root extract on human multiple myeloma cell line〔J〕.Food Chem Toxicol，2009;47(2):283-8.

7 徐美虹，吳開春，吳漢平.非甾體類抗炎藥對胃癌細胞增殖的抑制作用〔J〕.中華消化雜志，2002;22(4):199-202.

8 朱國民，殷放宙，鄧旭坤.布魯生抑制非小細胞肺癌細胞環(huán)氧化酶2表達的研究〔J〕.中國癌癥雜志，2009;19(9):671-7.