趙夢(mèng)中 靖彩霞 閆 婧 葛根塔娜

(1．包頭市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，內(nèi)蒙古 包頭 014060; 2．包頭市不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心，內(nèi)蒙古 包頭 014030)

希合日希精阿日樂(lè)嘎其(降糖1號(hào))為黃柏、梔子、香附、訶子、川楝子、紅花等11味藥組成的復(fù)方制劑，用于治療糖尿病。為了制定蒙藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到有效控制制劑內(nèi)在的質(zhì)量，采用高效液相色譜法建立了含量測(cè)定方法。以羥基紅花黃色素A作為測(cè)定指標(biāo)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索，確定了比較理想的色譜條件。并經(jīng)過(guò)方法學(xué)考察及陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，表明該方法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，專(zhuān)屬性強(qiáng)。方中其它組分對(duì)紅花中的有效成分羥基紅花黃色素A的測(cè)定無(wú)干擾，能夠控制該制劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1．1 儀器:島津 LC—10ATvp泵，SPD－10Avp型檢測(cè)器，島津CLASS－VP工作站，sartorious BP211D型電子天平。UV－1100型紫外分光光度儀(北京瑞利分析儀器公司)

1．2 試劑與試藥羥基紅花黃色素A對(duì)照品(批號(hào):111637－200905，供含量測(cè)定用):中國(guó)食品藥品檢定研究院;乙腈為色譜純(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)、甲醇為色譜純(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，水為高純水，其它試劑均為分析純。樣品由鄂爾多斯市烏審旗蒙醫(yī)院提供(批號(hào):090416、090518、090724)，模擬樣由包頭市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心制備。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2．1 色譜條件:色譜柱 Agilent TC－C18柱(150mm×4．6mm，5μm)色譜柱，填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠。以甲醇－乙腈－0．7%磷酸溶液(26:2:72)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)403nm，柱溫25℃。理論板數(shù)按羥基紅花黃色素A峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

對(duì)照品溶液的制備:精密稱(chēng)取羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量，加25%甲醇制成每1m l含30μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備:取本品粉末約2．2g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇溶液50mL，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率350W，頻率40kHz)40民，取出，放冷，再稱(chēng)定重量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照試驗(yàn):按本品的處方比例并以相同工藝制備不含紅花的陰性樣品。按2．1．3供試品溶液制備法制得陰性對(duì)照溶液。在2．1．1項(xiàng)色譜條件下，精密吸取陰性對(duì)照溶液、供試品溶液、羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀。測(cè)得結(jié)果為:陰性對(duì)照色譜圖中在與羥基紅花黃色素A對(duì)照品以及供試品色譜圖相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明其它組分對(duì)羥基紅花黃色素A的測(cè)定無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2．2 線性關(guān)系考察:取羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加25%甲醇制成每1mL含0．6mg的溶液(實(shí)際為34．29mg→50mL 的%甲醇，即得．6858mg·mL－1)，作為對(duì)照品溶液;精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液0．2、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2、1．4mL，分別置mL 量瓶中，加% 甲醇至刻度，搖勻。精密吸取10μL注入色譜儀測(cè)定，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行回歸分析，結(jié)果羥基紅花黃色素A在0．1372～0．9601μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為:Y=32464X+15043 r=1。

2．3 精密度試驗(yàn):精密吸取上述羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得羥基紅花黃色素A峰面積，計(jì)算RSD為2．2%。說(shuō)明該方法有良好的精密度。

2．4 穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一份供試品溶液，分別在0h、4h、8h、12h進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果可見(jiàn)，羥基紅花黃色素A在12h內(nèi)的峰面積積分值基本穩(wěn)定不變，RSD%為1．3%。該試驗(yàn)穩(wěn)定性良好。

2．5 重復(fù)性試驗(yàn):取同一批號(hào)(模擬樣批號(hào)090416)供試品6份，各約2．3g，精密稱(chēng)定，分別按2．1．3項(xiàng)下制成供試品溶液，按2．1．1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定羥基紅花黃色素A含量，平均含量為．733mg·g－1，RSD 為．52%．結(jié)果表明，該試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2．6 回收率試驗(yàn):取9份已知羥基紅花黃色素A含量供試品(批號(hào)，含量．733mg·g－1)，各約．2g，精密稱(chēng)定，分別置9個(gè)具塞錐形瓶中，分成3組每組3份，每組分別精密加入濃度為0．3606mg·mL－1(配制為:19．64mg×0．918/50mL)的羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液各1、2、3mL(約相當(dāng)于供試品含有量的50%、100%、120%)及相應(yīng)%甲醇溶液各49、48、47m L，分別按2．1．1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定每份供試品羥基紅花黃色素A含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 羥基紅花黃色素A回收率試驗(yàn)結(jié)果表(n=3)

2．7 樣品含量測(cè)定:批號(hào)不同的兩批樣品和一批模擬樣品，按“2．1．2”項(xiàng)“2．1．3”項(xiàng)下制成對(duì)照品溶液和供試品溶液。精密吸取羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液、供試品溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀，按2．1．1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算羥基紅花黃色素A的含量。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品中羥基紅花黃色素A含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3．1 流動(dòng)相的選擇:參照中國(guó)藥典2005年版一部“紅花”含量測(cè)定項(xiàng)下羥基紅花黃色素A的測(cè)定方法，以甲醇－乙腈－0．7%磷酸溶液(26:2:72)為流動(dòng)相進(jìn)行流動(dòng)相條件摸索。結(jié)果供試品色譜中的羥基紅花黃色素A具有較好的分離度，并具較適合的保留時(shí)間和理論板數(shù)，羥基紅花黃色素A的理論板數(shù)約為2500，故將流動(dòng)相定為甲醇－乙腈－0．7%磷酸溶液(26:2:72)。

3．2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇:精密稱(chēng)取羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量，用甲醇制成1mL含30μg的溶液，在200～500nm波長(zhǎng)范圍掃描。結(jié)果羥基紅花黃色素A在403．5nm處有最大吸收。參照中國(guó)藥典2005年版一部“紅花”含量測(cè)定項(xiàng)下羥基紅花黃色素A的測(cè)定方法，用403nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索，分離效果較好，陰性對(duì)照色譜圖中在與羥基紅花黃色素A對(duì)照品以及供試品色譜圖相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明其它組分對(duì)羥基紅花黃色素A的測(cè)定無(wú)干擾，故選用403nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3．3 提取溶劑、提取效率及提取溶劑加入量的考察:

3．3．1 提取溶劑的選擇:參照《中國(guó)藥典》2005年版一部“紅花”項(xiàng)下的羥基紅花黃色素A含量測(cè)定方法，選用25%甲醇作為提取溶劑。

3．3．2 提取效率的考察:以25%甲醇作為提取溶劑進(jìn)行超聲提取(功率350W，頻率40kHz)，為保證被測(cè)成分提取完全，實(shí)驗(yàn)中考察了超聲提取30min、40min和50min不同超聲提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響，結(jié)果超聲處理30min、40min和50min羥基紅花黃色素A的含量基本一致，故超聲提取時(shí)間定為40min。

3．3．3 提取溶劑加入量考察:在取樣量一致的情況下，提取過(guò)程中，對(duì)溶劑(25%甲醇)加入量25mL、50mL、75mL進(jìn)行考察，結(jié)果用25mL溶劑的樣品羥基紅花黃色素A含量較低，用50mL和75m l溶劑的樣品羥基紅花黃色素A含量基本一致，提取完全，故確定提取溶劑加入量為50mL。

3．3．4 曾采用高效液相色譜法測(cè)定處方中梔子藥材所含成分梔子苷的含量及黃柏藥材所含鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果陰性都有干擾

4 結(jié)論

本法用樣量少，方法簡(jiǎn)便，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為該蒙藥制劑質(zhì)量控制分析方法之一。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典［M］．一部．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:103