陳輝王云云劉艷

(1.廣州軍區(qū)武漢療養(yǎng)院，430074；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院，430030)

復(fù)合熒光RT-PCR技術(shù)檢測TBX2和p53在甲狀腺癌表達(dá)及臨床診斷意義

陳輝1王云云2劉艷2

(1.廣州軍區(qū)武漢療養(yǎng)院，430074；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院，430030)

目的 探討TBX 2、p53在正常甲狀腺組織、甲狀腺癌組織中的表達(dá)及臨床診斷意義。方法 采用復(fù)合熒光RT-P CR技術(shù)檢測45例甲狀腺癌組織和10例正常甲狀腺組織中TBX 2、p53基因mRN A的表達(dá)。結(jié)果 不同病理學(xué)類型甲狀腺癌TBX 2基因mRN A表達(dá)峰高與β-actin基因mRN A表達(dá)峰高之比在(1.283 2±0.354 5)～(2.37±0.488 9)，較正常甲狀腺明顯高(P＜0.01)；不同分化程度甲狀腺癌TBX2基因、β-actin基因mRN A表達(dá)平均峰高比值較正常甲狀腺明顯高(P＜0.01)。不同病理學(xué)類型甲狀腺癌p53基因mRN A表達(dá)峰高與β-actin基因mRN A表達(dá)峰高之比在(1.196 4±0.326 7)～(2.838 6±0.467 9)，較正常甲狀腺明顯高(P＜0.01)；不同分化程度甲狀腺癌p53基因、β-actin基因mRN A表達(dá)平均峰高比值較正常甲狀腺明顯高(P＜0.01)。結(jié)論 聯(lián)合檢測TBX 2和基因mRN A表達(dá)可為甲狀腺癌的早期診斷、預(yù)后判斷提供有價值的指標(biāo)。

甲狀腺癌；RT-P CR；mRN A；TBX 2；p53

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，居頭頸部惡性腫瘤之首，也是近年來發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一[1]。T-box蛋白質(zhì)2(TBX2)是T-BOX基因家族成員之一，屬于發(fā)育調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因，其在組織中表達(dá)上調(diào)，可作為腫瘤標(biāo)志物。p53基因是人類腫瘤中突變率最高的抑癌基因，其突變型p53能引起細(xì)胞增生失控導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。二者的表達(dá)異常均可作為甲狀腺癌早期診斷的參考依據(jù)之一。

為進(jìn)一步探討TBX2和p53異常表達(dá)在甲狀腺癌臨床診斷中的作用，本文采用復(fù)合熒光RT-PCR技術(shù)，同時檢測TBX2和p53基因的表達(dá)，并對其相關(guān)性進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 資料來源 回顧性收集某醫(yī)院2011—2012年接受甲狀腺癌手術(shù)切除甲狀腺組織45例，正常甲狀腺組織10例，組織均保存于－80℃冰箱中。甲狀腺癌及甲狀腺正常組織均經(jīng)病理學(xué)診斷確診。其中甲狀腺腺瘤9例，甲狀腺乳頭狀癌(PTC)15例，甲狀腺濾泡癌(FTC)12例，甲狀腺髓樣癌(MTC)8例，甲狀腺未分化癌(UTC)1例；按分化程度分化程度高11例，分化程度中12例，分化程度低22例。

1.2 研究方法

1.2.1 RNA提取 取甲狀腺組織1 g，用組織勻漿后提取，采用TRIzol快速法提取組織mRNA[2]。

1.2.2 引物設(shè)計 應(yīng)用Primer Premier5引物設(shè)計軟件設(shè)計特異性引物[1，3-4](表1)。

表1 引物設(shè)計

1.2.3 一步法RT-PCR擴(kuò)增法的建立 采用一步法逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系10μL。內(nèi)含RNA模板4μL，2×反應(yīng)Buffer 1μL(內(nèi)含有dNTP)，50 mM Mg2+0.45μL；p53濃度為0.4μmol/L，TBX2濃度為0.3μmol/L；β-actin濃度為0.15μmol/L；RT/Platinum Taq混合酶0.2μL，加Rnase-free的Milli-Q超純水補(bǔ)足至10μL。PCR擴(kuò)增條件：50℃×45 min×1 cycle；95℃×2 min×1 cycle，95℃×1 min，58℃×1 min，72℃×2 min，共30 cycles；72℃×10 min。然后4℃保存。

1.2.4 確定mRNA轉(zhuǎn)化的PCR產(chǎn)物 應(yīng)用ABI 310型DNA測序儀上的Genescan analysis 2.1 version軟件，通過與ROX-500標(biāo)準(zhǔn)分子量大小比對，確定TBX2、p53、β-actin基因mRNA轉(zhuǎn)化的PCR產(chǎn)物，并記錄測出每個特異性峰的峰高和峰面積。

1.3 統(tǒng)計分析 應(yīng)用t檢驗(yàn)，比較甲狀腺癌和正常組織TBX2、p53、β-actin基因mRNA表達(dá)的差異與變化[5]。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺癌組織和正常甲狀腺組織TBX2基因mRNA表達(dá)峰高的差異 運(yùn)用多重復(fù)合熒光RT-PCR技術(shù)，以及ABI 310型DNA測序儀上的Genescan analysis 2.1 version軟件對甲狀腺癌組織及正常甲狀腺組織進(jìn)行檢測，記錄甲狀腺腺瘤、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺未分化癌、正常甲狀腺組織進(jìn)行TBX2基因mRNA表達(dá)峰高與β-actin基因mRNA表達(dá)峰高之比(表2)。與正常甲狀腺組織相比，不同組織分類甲狀腺癌組織TBX2基因、β-actin基因mRNA表達(dá)峰高比值差異有顯著性。

不同分化程度甲狀腺癌TBX2基因、β-actin基因mRNA表達(dá)平均峰高比值(表3)與正常甲狀腺組織相比，不同病理分化程度甲狀腺癌組織TBX2基因、β-actin基因mRNA表達(dá)峰高比值差異有顯著性。

2.2 甲狀腺癌組織和正常甲狀腺組織p53基因mRNA表達(dá)峰高的差異 運(yùn)用多重復(fù)合熒光RT-PCR技術(shù)，以及ABI 310型DNA測序儀上的Genescan analysis 2.1 version軟件對甲狀腺癌組織及正常甲狀腺組織進(jìn)行檢測，記錄甲狀腺腺瘤、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺未分化癌、正常甲狀腺組織進(jìn)行p53基因mRNA表達(dá)峰高與β-actin基因mRNA表達(dá)峰高之比(表4)。與正常甲狀腺組織相比，不同組織分類甲狀腺癌組織p53基因、β-actin基因mRNA表達(dá)峰高比值差異有顯著性。

不同分化程度甲狀腺癌p53基因、β-actin基因mRNA表達(dá)平均峰高比值結(jié)果(表5)與正常甲狀腺組織相比，不同病理分化程度甲狀腺癌組織p53基因、β-actin基因mRNA表達(dá)峰高比值差異有顯著性。

表2 甲狀腺癌組織TBX2基因、β-actin基因mRNA表達(dá)平均峰高比值

表3 不同分化程度甲狀腺癌TBX2基因、β-actin基因mRNA表達(dá)平均峰高比值

表4 甲狀腺癌組織p53基因、β-actin基因mRNA表達(dá)平均峰高比值

表5 不同分化程度甲狀腺癌p53基因、β-actin基因m RNA表達(dá)平均峰高比值

3 討論

TBX2基因位于17號染色體長臂2區(qū)3帶(17q23)，是T-BOX基因家族成員之一，屬于發(fā)育調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因，通過其特有的TBOX區(qū)域參與多種生物的發(fā)育調(diào)控，其編碼蛋白TBX2主要通過功能域發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，TBX2在乳腺癌、胰腺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，并且與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤細(xì)胞增生以及細(xì)胞凋亡等有關(guān)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，TBX2 mRNA在甲狀腺腺瘤、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺未分化癌組織中表達(dá)的陽性率分別為1.196 4±0.326 7、1.587 9±0.378 7、2.373 2±0.357 4、2.564 7±0.486 9、2.838 6±0.467 9，與正常甲狀腺組織相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在不同分化程度的甲狀腺癌組織中，與正常甲狀腺組織相比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，提示TBX2 mRNA在甲狀腺癌組織中的表達(dá)有一定的特異性，且與甲狀腺癌組織的分化程度及組織學(xué)分型有關(guān)：甲狀腺癌組織分化程度越低，惡性程度越高，TBX2 mRNA表達(dá)越強(qiáng)。同樣，不同分化程度的甲狀腺癌組織，與乳頭狀癌、濾泡癌及髓樣癌組織相比較，TBX2表達(dá)差異也有顯著性，上述結(jié)果提示TBX2參與了甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

p53基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因。該基因定位于人類染色體17q13.1，全長約20 kb，編碼一個分子量為53 KDa的磷酸化蛋白。野生型p53蛋白可通過修復(fù)損傷的DNA等抑制腫瘤的生長，突變型則誘發(fā)機(jī)體免疫機(jī)制，產(chǎn)生針對p53的免疫抑制，逃避免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤的生長。人類許多腫瘤中均有不同程度的p53基因突變，在乳腺癌、肺癌、大腸癌、胃癌等腫瘤中突變型p53通常高水平表達(dá)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)p53在正常甲狀腺組織未見表達(dá)，而在不同組織類型、不同分化的甲狀腺癌組織均有表達(dá)，且低分化程度越低，甲狀腺癌組織中的p53表達(dá)越高；不同組織類型中，也表現(xiàn)出一定的差異性，甲狀腺髓樣癌組織中p53表達(dá)高于甲狀腺濾泡癌及乳頭狀癌組織，差異有顯著性。提示p53同樣也參與了甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，其表達(dá)與甲狀腺癌分化差、惡性程度高、預(yù)后差有密切關(guān)聯(lián)，可將其作為臨床診斷、治療的觀察指標(biāo)之一。對于TBX2、p53在參與了甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制，推測認(rèn)為：有一定的協(xié)同作用，TBX2、p53在甲狀腺癌組織中高表達(dá)可能是甲狀腺癌惡性程度高、增生迅速的原因之一，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

在檢測手段方面，本研究應(yīng)用熒光標(biāo)記及多重半定量RT-PCR技術(shù)研究TBX2、p53基因表達(dá)，選擇的TBX2、p53基因產(chǎn)物長度分別為211 bp、194 bp相差不大，產(chǎn)物間可能重疊，可在TBX2、p53兩基因正鏈的5’端分別掛上6-FAM(蘭色標(biāo)記)、HEX(綠色標(biāo)記)；由于管家基因β-actin產(chǎn)物為353 bp，與TBX2、p53兩基因表達(dá)產(chǎn)物片段長度差異較大。因此，在β-actin基因的正鏈的5’端分別掛上6-FAM(蘭色標(biāo)記)。將TBX2、p53基因及管家基因β-actin基因放在同一EP管中進(jìn)行同時、同步RT-PCR擴(kuò)增，其RT-PCR擴(kuò)增片段長度相近的產(chǎn)物可以通過片段峰的顏色加以區(qū)分。所以，應(yīng)用熒光標(biāo)記可以實(shí)現(xiàn)多重RT-PCR。

對產(chǎn)物的定量分析，常規(guī)RT-PCR半定量研究多常用瓊脂糖凝膠電泳、圖像掃描分析技術(shù)，對RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行灰度間比較，其分析結(jié)果與電泳、攝影技術(shù)密切相關(guān)，有時甚至可影響科研結(jié)果。熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物可以準(zhǔn)確測定各特異性基因的熒光峰高、峰面積，對各基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析[8]。在進(jìn)行RT-PCR半定量研究方面，熒光標(biāo)記、多重復(fù)合RT-PCR、毛細(xì)管電泳及激光掃描技術(shù)有著巨大的優(yōu)勢和應(yīng)用前景。

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Objective To explore the expression and clinical significance of TBX2 and p53 in normal thyroid tissue and thyroid cancer.Methods Multiplex fluorescent RT-PCR was adopted to detect the expression of gene mRNA in TBX2 and p53 in 45 cases w ith thyroid cancer tissue and 10 cases with normal thyroid tissue.Results The ratio of TBX2 mRNA expression peak height toβ-actin mRNA expression peak height in different pathologic types of thyroid cancer ranged from(1.283 2±0.354 5)to(2.37±0.488 9)，and it was significantly higher than normal thyroid(P＜0.01)；the average mRNA expression peak height of TBX2 gene and β-actin gene in different degree of thyroid cancer was significantly higher than normal thyroid(P＜0.01).The ratio of p53 mRNA expression peak height toβ-actin mRNA expression peak height in different pathologic types of thyroid cancer ranged from(1.196 4±0.326 7)to(2.838 6±0.467 9)，and itwas significantly higher than normal thyroid(P＜0.01)；the average mRNA expression peak height of p53 gene and β-actin gene in different degree of thyroid cancer was significantly higher than normal thyroid(P＜0.01).Conclusion Joint detection of the expression of gene mRNA in TBX2 and p53 can provide valuable indicators for early diagnosis and prognosis of thyroid cancer.

Thyroid cancer；RT-PCR；mRNA；TBX2；p53

1005-619X(2013)09-0777-03

劉艷

2013-07-05)