唐 克，洪 新

（遼寧工業(yè)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

柴油中含有少量的氮化物，二次加工柴油中氮化物含量更高，氮化物的存在直接或間接影響柴油的顏色和氧化安定性，對柴油的質(zhì)量影響較大。并且在柴油的催化加工過程中，氮元素易使催化劑中毒［1－2］。另外氮化物在燃燒時(shí)產(chǎn)生的大量NOx會(huì)對大氣造成嚴(yán)重污染［3］。目前，油品中氮化物的脫除方法主要有加氫精制和非加氫精制，采用加氫精制法可對柴油進(jìn)行深度脫氮，但脫除含氮雜環(huán)化合物（如喹啉等）需在較苛刻的高溫、高壓下操作，不僅所需的費(fèi)用高，且危險(xiǎn)系數(shù)高；非加氫精制方法主要有絡(luò)合萃取精制［4］、酸堿精制［5］、溶劑精制［6］等，雖然這些方法各有優(yōu)勢，但也都存在一定的不足，最主要的是操作條件苛刻，產(chǎn)生二次污染。近些年發(fā)展起來的微生物脫氮技術(shù)以其投資費(fèi)用低、設(shè)備簡單、操作條件溫和、不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)逐步受到各行各業(yè)的青睞，并在石油微生物脫硫、微生物石油勘探、石油二次開采、脫蠟等方面取得了很大的成績，有些已實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化［7］。喹啉作為油品中典型的含氮雜環(huán)化合物，其微生物脫除方法已經(jīng)得到了廣泛的研究，Edward［8］，Schwarz［9］，O’Loughlin［10］分別篩選出了降解喹啉較好的菌株。本研究在前期工作［11］中已經(jīng)分離篩選出降解喹啉較好的菌株HY9，但該菌株用于柴油脫氮時(shí)脫氮率較低，因此對營養(yǎng)鹽與柴油體積比、表面活性劑Tween80加入量及搖床轉(zhuǎn)速等各因素對菌株脫除柴油中含氮雜環(huán)化合物的影響進(jìn)行研究，為微生物在油品脫氮中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 樣品和培養(yǎng)基

菌株來源于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的HY9菌株；培養(yǎng)基［12］：KH2PO40.265g，Na2HPO40.426g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001g，MgSO4·7H2O 0.02g，CaCl2·2H2O 0.002g，去離子水100mL，葡萄糖2g，pH值為7.0。

1.2 分析方法

堿氮含量的測定采用SH／T 0162—1992方法；細(xì)胞生長量測定采用比濁法；喹啉濃度的測定采用紫外分光光度法。

2 結(jié)果與討論

2.1 無機(jī)氮對喹啉降解的影響

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［13－14］，喹啉在微生物降解過程中，其中的氮是以氨氮的形式溶于培養(yǎng)基中。因此，為確定溶解在培養(yǎng)基中的銨氮是否影響菌株進(jìn)一步降解喹啉，實(shí)驗(yàn)中選擇（NH4）2SO4作為無機(jī)氮源，研究（NH4）2SO4的加入對喹啉降解的影響。配制100 mL液體培養(yǎng)基6份，其中3份分別添加0.2g（NH4）2SO4、喹啉用量分別為0.07，0.14，0.18mL；另外3份不加無機(jī)氮（NH4）2SO4，喹啉用量分別為0.07，0.14，0.18mL。在溫度為35℃、轉(zhuǎn)速為125 r／min、pH值為7.0的條件下，搖床培養(yǎng)4天，測定OD600（消光系數(shù)）和脫氮率，結(jié)果見表1。從表1可以看出，無機(jī)氮的加入對于菌株HY9的生長及喹啉降解無明顯影響，但喹啉用量對其影響較大，當(dāng)喹啉用量為0.07mL時(shí)，菌株生長情況及脫氮率均低于喹啉用量為0.14mL時(shí)的情況，這是由于菌株生長及其對喹啉的代謝降解過程同步進(jìn)行，喹啉作為菌株生長的氮源，為微生物生長提供所需氮源，促進(jìn)菌株的生長，低的喹啉用量不能滿足菌株生長所需的氮源，故生長和降解能力均較低；但當(dāng)喹啉用量為0.18mL時(shí)，其OD600和喹啉脫氮率也低于喹啉用量為0.14mL時(shí)的情況，這是因?yàn)猷卸荆髣┝康泥坏珪?huì)抑制菌株生長甚至可能使微生物死亡，也有可能是由于菌株生長代謝產(chǎn)物的積累抑制了菌株的生長。為了進(jìn)一步考察喹啉加入量對菌株生長的影響，僅改變液體培養(yǎng)基中喹啉加入量，考察菌株生長情況，結(jié)果見圖1。由圖1可見，菌株對喹啉的最大耐受用量為0.14mL，超過0.14mL時(shí)，菌株生長受到限制。因此確定16.7mL培養(yǎng)基中喹啉加入量不得超過0.14mL。

表1 無機(jī)氮對HY9菌株生長及喹啉降解的影響

圖1 喹啉加入量對菌株生長的影響

2.2 營養(yǎng)鹽與柴油體積比對柴油脫氮的影響

根據(jù)HY9降解喹啉實(shí)驗(yàn)所確定的最佳培養(yǎng)條件，擴(kuò)大培養(yǎng)HY9菌株，制備菌懸液（菌濃度108個(gè)／mL），用于柴油脫氮處理。分別稱取25 mL柴油于4個(gè)錐形瓶，按營養(yǎng)鹽與柴油體積比分別為1∶1，1.5∶1，2∶1，2.5∶1加入營養(yǎng)鹽，滅菌后，分別加入3mL菌懸液，在35℃、轉(zhuǎn)速為125 r／min的條件下，搖床培養(yǎng)4天，靜止分層后，測定柴油脫氮率，結(jié)果見表2。從表2可以看出，柴油與營養(yǎng)鹽混合比例對柴油脫氮的效果影響不大。這主要是因?yàn)椴裼退苄圆?，在營養(yǎng)鹽中的溶解度較低，而微生物脫氮對象是油和水構(gòu)成的混合液，油在水中乳化性差，水中油含量低，微生物發(fā)酵降解所進(jìn)行的生化反應(yīng)都是在水相中進(jìn)行的，所以菌體接觸柴油的幾率較小，脫氮效果差，設(shè)法提高柴油在營養(yǎng)鹽中的溶解度是提高菌株的柴油脫氮率的關(guān)鍵?？紤]實(shí)際操作情況及費(fèi)用，選取營養(yǎng)鹽與柴油的體積比為1.5∶1。

表2 營養(yǎng)鹽與柴油體積比對柴油脫氮效果的影響

2.3 表面活性劑對柴油脫氮的影響

采用多元醇類非離子型表面活性劑Tween80來增強(qiáng)油水混溶性，非離子型表面活性劑在水溶液中不發(fā)生電離，親水基部分為多聚氧乙烯基，其親水性能由所含的氧乙烯基的數(shù)目來控制，不但穩(wěn)定性較高，而且不易受酸堿和強(qiáng)電解質(zhì)無機(jī)鹽的影響。稱取0.15g Tween80、37.5mL營養(yǎng)鹽和25mL柴油加入到250mL錐形瓶中，滅菌后于35℃、125r／min搖床轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)4天，培養(yǎng)后將混合液靜置分層，由于Tween80的增溶作用，需靜置較長時(shí)間。分層后取上層油，采用高氯酸滴定法測定堿氮含量，結(jié)果見表3。從表3可以看出，加入Tween80后，柴油的脫氮效果明顯增加，脫氮率由12.9%增加到16.7%。

表3 Tween80對柴油脫氮效果的影響

2.4 表面活性劑加入量對柴油脫氮的影響

分別稱取0.100，0.175，0.200，0.250g Tween80，加入到含柴油25mL、營養(yǎng)鹽37.5mL的錐形瓶中，滅菌后，加入菌懸液3mL，在35℃、250r／min轉(zhuǎn)速條件下?lián)u床培養(yǎng)4天，測定柴油脫氮率，結(jié)果見表4。由表4可見，加入0.175g Tween80時(shí)，柴油脫氮率最大，為19.3%。另外，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明，隨著Tween80加入量的增加，油水分層時(shí)間延長。因此，確定25mL柴油中最佳Tween80加入量為0.175g。

表4 表面活性劑加入量對柴油脫氮的影響

2.5 搖床轉(zhuǎn)速對柴油脫氮的影響

搖床轉(zhuǎn)速一方面會(huì)提高柴油與營養(yǎng)鹽的混合效果，另一方面會(huì)增加菌株與柴油的接觸幾率。稱取4份0.175g的Tween80，分別加到含37.5mL營養(yǎng)鹽和25mL柴油的250mL錐形瓶，滅菌后加入菌懸液3mL，在35℃、搖床轉(zhuǎn)速分別為125，175，250，300r／min的條件下培養(yǎng)4天，測定柴油脫氮率，結(jié)果見表5。從表5可以看出，在Tween80存在的條件下，適當(dāng)提高搖床轉(zhuǎn)速有利于提高柴油脫氮率，轉(zhuǎn)速為250r／min時(shí)的脫氮率是125r／min時(shí)的1.2倍。這是因?yàn)樘岣邠u床轉(zhuǎn)速，可減小油水微粒的粒徑、增加溶液中的溶解氧含量，而溶解氧對于提高好氧微生物的降解作用主要體現(xiàn)在以下兩個(gè)方面：①作為氧化還原代謝過程的最終電子受體；②參與甾醇類和脂肪酸的合成。因此溶解氧的增加促進(jìn)了柴油的脫氮效果。在表面活性劑存在的條件下，增大搖床轉(zhuǎn)數(shù)，可以減小油水形成的微乳狀液滴尺寸，增加比表面積，進(jìn)而增加油水接觸界面，提高微生物與柴油中含氮化合物的接觸機(jī)會(huì)，增強(qiáng)生物催化脫氮作用。當(dāng)轉(zhuǎn)速增加到300r／min時(shí)，微生物脫氮效率趨于穩(wěn)定。因此確定250r／min為最佳搖床轉(zhuǎn)速。

表5 搖床轉(zhuǎn)速對柴油物脫氮效果的影響

2.6 接種量對柴油脫氮的影響

按營養(yǎng)鹽與柴油體積比為1.5∶1配置6組100mL的混合液，分別加入0.175g Tween80，高溫滅菌后，分別加入0.5，1，2，3，4，5，6mL菌懸液（菌濃度108個(gè)／mL），在35℃、250r／min的條件下?lián)u床培養(yǎng)4天，測定柴油脫氮率，結(jié)果見圖2。由圖2可見，接種量低于3mL時(shí)，最初由于接種量過少，生長緩慢，發(fā)酵周期長，脫氮率較低，但隨著接種量的增加，柴油的脫氮率增加，由最初的6.86%增加到接種量為3mL時(shí)的19.5%，這是因?yàn)殡S著接種量的增加，接入的菌株量增加，與柴油中含氮化合物的接觸幾率增加，使脫氮率增加；接種量高于3mL時(shí)，柴油的脫氮率并沒有明顯的增長，而接種量過高時(shí)會(huì)提高成本。因此確定100mL混合液加入3mL菌懸液為最佳接種量。

圖2 接種量對柴油脫氮效果的影響

2.7 脫氮次數(shù)對柴油脫氮的影響

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株HY9對柴油的脫氮效果不是很理想，最高脫氮率也僅為19.5%左右，若要提高脫氮率可進(jìn)行多次降解，因此考察了脫氮次數(shù)對柴油脫氮效果的影響。將一次脫氮后的柴油分層萃取滅菌后，按上述實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)條件加入營養(yǎng)鹽和表面活性劑，在35℃、250r／min的條件下?lián)u床培養(yǎng)4天，將混合液分層萃取，取上層柴油測定脫氮率，如此重復(fù)進(jìn)行3次。結(jié)果表明，脫氮次數(shù)分別為1～4次時(shí)，對應(yīng)的脫氮率分別為19.3%，19.8%，21.1%，21.2%。增加柴油脫氮次數(shù)，脫氮率僅有小幅提高，脫氮效果并不是很明顯，這有可能是該菌株只對部分含氮雜環(huán)化合物有降解作用，而對另外一些含氮雜環(huán)化合物的降解能力極弱或不能降解，所以通過多次降解來提高柴油脫氮效果的方式不可取。若要進(jìn)一步提高菌株的脫氮效果，應(yīng)加強(qiáng)菌株的分子生物學(xué)及酶學(xué)研究，進(jìn)行基因重組，構(gòu)建優(yōu)良菌株，提高脫氮效果。影響微生物脫氮的另一個(gè)關(guān)鍵問題是菌株對喹啉等有機(jī)氮化物的吸收能力，它與菌株和有機(jī)相的接觸情況及有機(jī)氮化物在液相中可溶性有關(guān)，因?yàn)榕c微生物脫氮效果密切相關(guān)的三個(gè)因素為微生物對有機(jī)氮化物的依附情況、輔助吸收機(jī)制及物質(zhì)的擴(kuò)散。加強(qiáng)傳質(zhì)過程研究，采取一定有效措施，進(jìn)一步增加菌株的疏水性，提高其親油性，將會(huì)有效提高柴油的脫氮效率。

3 結(jié) 論

（1）采用HY9菌株降解喹啉時(shí)，無機(jī)氮源（NH4）2SO4的加入對喹啉的降解基本無影響，16.7 mL培養(yǎng)基中菌株對喹啉的耐受用量為0.14mL。

（2）非離子表面活性劑Tween80的加入，增強(qiáng)了油水混溶性，柴油脫氮率從12.9%增加到16.7%，脫氮率明顯提高，具有較好的增溶性；25mL柴油中Tween80的最佳添加量為0.175g；搖床轉(zhuǎn)速影響菌株對柴油中含氮化合物的降解能力，最佳搖床轉(zhuǎn)速為250r／min；100mL混合液加入3mL菌懸液為最佳接種量；最佳營養(yǎng)鹽與柴油體積比為1.5∶1；增加脫氮次數(shù)對柴油的脫氮效果影響較小。

［1］全向春，韓力神，王建龍.固定化皮氏伯克霍而德氏菌降解喹啉的研究［J］.環(huán)境科學(xué)，2000，21（3）：74－76

［2］范印帥，劉淑芝，孫蘭蘭.柴油脫氮精制技術(shù)研究進(jìn)展［J］.化工科技，2007，15（2）：63－66

［3］李力，于波，許平.化石燃料生物脫有機(jī)氮研究展望［J］.中國生物工程雜質(zhì)，2004，24（6）：64－67

［4］齊江，延玉臻.催化裂化柴油氮化物的絡(luò)合萃?。跩］.石油化工，1998，27（2）：106－109

［5］林賽燕，劉丹，王紅.酸性離子液體萃取脫除焦化柴油中堿性氮化物［J］.石油化工高等學(xué)校學(xué)報(bào)，2012，25（1）：8－12

［6］南軍，耿姍，張景成.離子液體脫氮－加氫精制處理高氮焦化汽柴油的研究［J］.工業(yè)催化，2011，19（12）：63－66

［7］夏亞穆，李思東，楊豐科.生物催化劑改良化石燃料的研究進(jìn)展［J］.工業(yè)催化，2007，15（10）：16－19

［8］Edward J，O’Loughlin，Staci R.Isolation，characterization，and substrate utilization of a quioline－degrading bacterium［J］.International biodeterioration ＆ biodegadation，1996，47：107－118

［9］Schwarz G.Isolation and characterization of quinoline－degrading bacteria［J］.System Appl Microbiol，1998，10：185－190

［10］O’Loughlin E J，Kehrmeyer S R，Sims G K.Isolation，characterization and substrate utilization of a quinoline－degrading bacterium［J］.International Biodeterioration and Biodegradation，1996，38（2）：107－118

［11］Hong Xin，Tang Ke.Isolation，chatacterization and diesel oil denitrification of a quinoline－degrading bacterial［J］.Petroleum Science and Technology，2010，28（18）：1878－1883

［12］Kilbane.Microorganisms useful for cleavage of organic C—N bonds：The United States，US 6204048［P］.2001－03－20

［13］Ruger A，Schwarz G，Lingens F.Microbial metabolism of quinoline and related compounds.ⅪⅩ.Degradation of 4－methylquinoline and quinoline by Pseudomonas putida K1［J］.Biol Chem Hoppe Seyler，1993，374（7）：479－88

［14］Bai Yaohui，Sun Qinghua，Zhao Cui，et al.Quinoline biodegradation and its nitrogen transformatation pathway by aPseudomonas sp.strain［J］.Biodegradation，2010，21：335－344