張曉軍，李春英，劉帥華，劉德曼，李 朝，施昆明，趙春建*

（1.吉林省林業(yè)科學(xué)研究院，長春130033;2.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150040）

山竹（Garcinia mangostanaL.）又稱山竹子、鳳果、莽吉柿，是藤黃科（Guttiferae）藤黃屬（Garcinia）常綠喬山竹的果實，原產(chǎn)于馬來西亞和印度尼西亞，是一種典型的熱帶水果，主要分布于泰國、越南、馬來西亞、印度尼西亞和菲律賓等東南亞國家，我國臺灣、福建、云南和廣東也有引種［1］。山竹果皮一直作為泰國傳統(tǒng)醫(yī)藥用于腹痛、腹瀉、痢疾、感染性創(chuàng)傷、慢性潰瘍、白帶、淋病、乳腺癌、白血病、肝癌等疾病治療［2－6］。近年來，山竹特別是山竹果皮的化學(xué)成分及其生物學(xué)活性成為人們的研究熱點［7－9］。本文旨在探討山竹抗氧化活性物質(zhì)的提取工藝，為山竹果皮的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

近年來，超聲技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中已顯示出巨大的優(yōu)勢［10－12］，利用超聲波產(chǎn)生的振動、空化效應(yīng)、攪拌作用等可以加速植物有效成分進(jìn)入溶劑，提高提取率，縮短提取時間，簡化提取操作步驟。本文以山竹果皮為原料，采用超聲法對其中抗氧化活性物質(zhì)提取的方法進(jìn)行研究，獲得優(yōu)化的超聲提取條件，為山竹果皮的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山竹購自哈爾濱市水果市場，去除果肉，果皮氣干后，用小型粉碎機(jī)粉碎后進(jìn)行提取。

1，1－二苯基－2－苦基肼（DPPH）、兒茶素、β－胡蘿卜素（Sigma公司）;乙醇、氯仿、亞油酸、吐溫、三羥甲基氨基甲烷，鹽酸，鎢酸鈉，鉬酸鈉，磷酸，液溴 （以上試劑均為分析純）;實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 主要儀器與設(shè)備

KQ5200DB型超聲波清洗儀，昆山市超聲波儀器有限責(zé)任公司;5418型離心機(jī)，Eppendorf公司;UV－2550型紫外－可見分光光度計，島津公司，日本;PHSJ－5型pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司;HYQ－2121A型渦旋混勻器，南京暢翔儀器設(shè)備有限責(zé)任公司;R－1001－V/VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.3 樣品溶液的制備

山竹果皮60℃烘干、用小型粉碎機(jī)粉碎、過60目篩。精確稱取山竹果皮粉若干份，每份1.5 g，分別加一定量的提取溶劑進(jìn)行提取，提取液過濾、定容至50 mL，濾液離心取上清、待測。

1.4 DPPH法檢測抗氧化性

參考Gyamfi等的方法［13］，并做適當(dāng)調(diào)整。取1 000 μL DPPH 乙醇溶液（0.1 mm）、450 μL Tris－HCl緩沖液（50 mm，pH 7.4）與 100 μL樣品或兒茶素溶液，渦旋混勻后避光靜置30 min，于517 nm下測定吸光值。以100 μL與樣品溶液濃度相同的乙醇代替樣品同法操作，為對照。本試驗3次重復(fù)。根據(jù)吸光值計算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率式中:Aa為試驗組吸光值;AC為對照組吸光值。

1.5 β－胡蘿卜素漂白法檢測抗氧化性

參照陳炳華等［14］的方法進(jìn)行檢測。

1.6 總酚含量測定

總酚含量按照Kujala等的Folin－Ciocalteu法測定［15］，并適當(dāng)修改，以兒茶素為對照品進(jìn)行檢測。試驗時，取500 μL Folin－Ciocalteu試劑（1 N）加入500 μL不同濃度兒茶素于離心管中，渦旋混勻30s，并靜置5 min后，添加1 mL 20%Na2CO3再靜置10 min，離心，取上清液，于730 nm測定吸光值，并根據(jù)此吸光值與兒茶素濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品分析時，以500 μL樣品取代兒茶素，其余操作同上。將樣品吸光值代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出每毫升提取液中所含兒茶素相對量，并以此表示總酚含量，本試驗3次重復(fù)。

1.7 山竹果皮抗氧化活性成分超聲提取工藝的正交試驗設(shè)計

在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，分別以乙醇濃度 （A）、超聲時間 （B）、超聲溫度 （C）和液料比 （D）為影響因素，以100μL提取液的DPPH自由基清除率為指標(biāo)，進(jìn)行L16（45）正交試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件對山竹果皮提取液DPPH自由基清除率的影響

對正交試驗的結(jié)果進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗，正交試驗結(jié)果、方差分析結(jié)果分別見表1和表2。

表1 L16（45）正交試驗結(jié)果Tab.1 Results of L16（45）orthogonal experiment

表2 DPPH自由基清除率的方差分析Tab.2 Variance analysis of scavenging rate on DPPH free-radical

2.2 正交試驗結(jié)果分析

由表1的極差和表2的方差分析結(jié)果可以看出，4種因素對超聲提取結(jié)果影響大小依次為:乙醇濃度A＞超聲時間B＞超聲溫度C＞液料比D。以影響最大的2個因素乙醇濃度和超聲時間對提取液DPPH自由基清除率作圖，結(jié)果如圖1所示。

圖1 乙醇濃度和提取時間對提取液清除DPPH能力影響Fig.1 The effect of ethanol concentration and extraction time on scavenging DPPH of the extracts

根據(jù)極差分析結(jié)果，確定在試驗設(shè)計的范圍內(nèi)，最優(yōu)的試驗方案為 A2B3C3D1，即乙醇濃度60%、超聲時間30 min、超聲溫度40℃和液料比10 mL/g。

2.3 抗氧化活性成分超聲提取的數(shù)學(xué)模擬

對超聲提取的試驗結(jié)果進(jìn)行逐步回歸分析，并剔除最小的影響因素液料比，得到回歸方程:

式中:X1為乙醇濃度;X2為超聲時間，min;X3為超聲溫度，℃;Y為DPPH自由基清除率，%。

方程回歸系數(shù)R=0.9652，可以看出模擬值與試驗值擬合良好，說明數(shù)值模擬是成功的。

根據(jù)方程對最佳提取條件進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果見表3。

表3 最優(yōu)解預(yù)測Tab.3 Prediction of optimum solution

從表3可以看出，擬合的方程預(yù)測的最優(yōu)解與正交試驗極差和方差的分析結(jié)果基本一致。由于在試驗范圍內(nèi)，液料比對提取率的影響不顯著，綜合考慮工藝成本，最終確定最佳工藝條件為乙醇濃度65%、超聲時間32 min、超聲溫度41℃和液料比10 mL/g。為了確認(rèn)擬合方程預(yù)測的最優(yōu)組合的可信性，進(jìn)行優(yōu)化組合的驗證試驗，測得此條件下100μL提取液的DPPH自由基清除率為66.8%，與方程的預(yù)測值接近，重復(fù)試驗相對偏差為1.82%（n=3），說明方程優(yōu)化的超聲提取工藝條件可信。

2.4 山竹果皮提取物抗氧化活性初步分析

圖2 山竹果皮提取物清除DPPH自由基的能力Fig.2 Free-radical scavenging activity of the extracts from mangosteen pericarp on DPPH assay

山竹果皮的抗氧化能力是由多種物質(zhì)共同作用的結(jié)果，僅有部分物質(zhì)結(jié)構(gòu)組成已被鑒定，但仍有一些成分結(jié)構(gòu)及其存在方式仍不明確。由于植物成分的體外抗氧化能力大部分與酚類化合物有關(guān)，因此，將最優(yōu)化提取條件下得到的提取液濃縮至干，干燥物溶于乙醇，測定了總酚含量，經(jīng)計算干燥物總酚含量為492.3 mg/g兒茶素。為了評價山竹果皮乙醇提取物的抗氧化能力，對不同濃度的兒茶素和乙醇提取液干燥物樣品清除DPPH自由基能力、抑制β胡蘿卜素漂白的能力進(jìn)行了測定，結(jié)果分別如圖2和圖3所示。從圖2可以看出，乙醇提取物的對DPPH自由基的清除率隨濃度的增加而增大，經(jīng)計算，其對DPPH自由基清除的IC50值為8.4 μg/mL，與公認(rèn)的天然抗氧化劑兒茶素的IC50值接近（7.6μg/mL）;從圖3可以看出，乙醇提取物對β－胡蘿卜素漂白的抑制率隨濃度的增加而增大，經(jīng)計算，其對β－胡蘿卜素漂白抑制的IC50值為 52.6μg/mL，而兒茶素的 IC50值大于200 μg/mL，說明山竹果皮提取物具有較強的抗氧化能力。

圖3 山竹果皮提取物對β－胡蘿卜素漂白的抑制能力Fig.3 Inhibitory effect of the extracts from mangosteen pericarp on β-carotene bleaching

3 結(jié)束語

利用DPPH自由基清除能力作為抗氧化性成份的提取指標(biāo)，采用正交試驗優(yōu)化了山竹中抗氧化活性成分的提取工藝條件，即最佳工藝條件為乙醇濃度65%、超聲時間32 min、超聲溫度41℃和液料比10 mL/g。山竹果皮提取物具有較高的清除DPPH自由基和對β－胡蘿卜素漂白的抑制能力，其具體抗氧化成份有待于進(jìn)一步研究，并評估其抗氧化應(yīng)用的可行性。

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