閔成軍，朱志盈，李小勇，金玉勝，武花鋒，文美英

(江蘇雨潤(rùn)肉類(lèi)產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇南京210041)

克侖特羅，異名克喘素、氨哮素，俗名“瘦肉精”，化學(xué)名為α-［(叔丁胺基)甲基］-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽［1-2］。克侖特羅屬于β-興奮劑類(lèi)藥物，在人醫(yī)和獸醫(yī)上用來(lái)治療哮喘。20世紀(jì)80年代初，美國(guó)Cyanamid公司意外發(fā)現(xiàn)將高于治療劑量5～10倍(即＞1g/kg·d)的克侖特羅添加于飼料飼喂動(dòng)物后可明顯促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、改善胴體品質(zhì)、提高瘦肉率，克侖特羅作為一種非法飼料添加劑被許多專(zhuān)業(yè)飼養(yǎng)戶(hù)和飼料加工企業(yè)所使用，已經(jīng)成為了重大的食品安全問(wèn)題［3-4］。90年代初期以來(lái)，出現(xiàn)多起克侖特羅中毒事件，并出現(xiàn)了死亡案例，因此被世界禁止使用。然而由于經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使，國(guó)內(nèi)許多不法養(yǎng)殖場(chǎng)仍非法使用。目前分析檢測(cè)克侖特羅的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法(ELISA)和免疫膠體金檢測(cè)方法［5-8］。經(jīng)典的色譜法已不能滿(mǎn)足大量檢測(cè)任務(wù)的需要，因此ELISA快速檢測(cè)試劑盒由于其方便、快速和靈敏檢測(cè)而被廣泛應(yīng)用。國(guó)內(nèi)有關(guān)克侖特羅檢測(cè)的報(bào)道主要集中在生豬尿樣、肝臟、肌肉組織［9-10］，而未見(jiàn)ELISA法檢測(cè)牛血液樣品的前處理的報(bào)道。在規(guī)?；幕钆Ｍ涝讏?chǎng)，ELISA方法是較為理想的牛血液克侖特羅殘留篩選性分析方法之一，但是牛血液樣品放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、血樣品溶血、血樣品被細(xì)菌污染、補(bǔ)體、膽紅素等，均可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，而血清樣品儲(chǔ)存過(guò)久可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，因此，牛血液樣品前處理質(zhì)量是保證檢驗(yàn)結(jié)果可靠性的重要環(huán)節(jié)。本工作采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)方法對(duì)牛血液樣品的前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，采用ELISA方法進(jìn)行克侖特羅殘留的篩選，采用LC-MS/MS法對(duì)篩選出的牛血液陽(yáng)性樣品進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)，為規(guī)?；钆Ｍ涝讖S(chǎng)控制克侖特羅假陽(yáng)性結(jié)果提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)用牛血液樣品 實(shí)驗(yàn)前即時(shí)采取;克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品 純度99%以上，美國(guó)Sigma公司;克侖特羅酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒 杭州迪恩科技有限公司;抗凝劑 0.48g檸檬酸，1.37g檸檬酸鈉，1.48g葡萄糖用60mL純水溶解后，定容至100mL，4℃保存;甲醇、甲酸 色譜純;β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶 美國(guó)Sigma公司;乙酸銨、氫氧化鈉、異丙醇、乙酸乙酯和氨水 分析純，北京化學(xué)試劑公司。

FA2004V電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;Thermo微量移液器 賽默飛世爾(上海)儀器有限公司;TDZ5-WS臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司;Model680酶標(biāo)儀 美國(guó);KS康氏振蕩器 金壇市富華儀器有限公司;TQU02361 LC-MS/MS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海榮華生化儀器廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 血樣離心前放置時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響采集5頭牛靜脈血，每頭牛靜脈血12管，每管5mL，分別記錄采血時(shí)間并編號(hào)，血液樣品中未添加抗凝劑。取同一樣品的其中6管血樣于室溫分別放置0、30、60、90、120、150min 后，3000r/min 離心 10min 后即刻檢測(cè)每份樣品中克侖特羅的殘留量。取另外6管血樣于室溫分別放置 0、30、60、90、120、150min 后，存放于4℃冰箱保存過(guò)夜，次日將血樣從冰箱中取出，3000r/min離心10min，待血清樣品恢復(fù)至室溫時(shí)開(kāi)始檢測(cè)每份樣品中克侖特羅的殘留量。

1.2.1.2 血樣離心后放置時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響采集5頭牛靜脈血，每頭牛靜脈血3管，每管5mL，分別記錄采血時(shí)間并編號(hào)，血液樣品中未添加抗凝劑。將血樣于室溫放置30min后，3000r/min離心10min待測(cè)。分別測(cè)定相應(yīng)血樣離心后放置時(shí)間0、30、60、90、120、180min、4℃ 冰箱過(guò)夜保存后的每份樣品中克侖特羅的殘留量。

1.2.1.3 血樣中抗凝劑添加比例對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響采集5頭牛靜脈血，每頭牛靜脈血6管，抗凝劑與血液的比例分別為:不加抗凝劑、1∶9、1∶8、1∶6、1∶4、1∶3，分別記錄采血時(shí)間并編號(hào)。血樣于室溫(20～25℃)放置 30min后，3000r/min離心 10min。取離心后同一樣品的血清即刻檢測(cè)克侖特羅的殘留量，檢測(cè)后余下的血清加蓋于4℃冰箱保存過(guò)夜，次日將血清從冰箱中取出，待恢復(fù)室溫后分別檢測(cè)每份血清樣品中克侖特羅的殘留量。

1.2.2 正交實(shí)驗(yàn) 以血液離心前放置時(shí)間、離心后放置時(shí)間、抗凝劑添加比例3個(gè)因素按L9(34)正交表進(jìn)行3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal array design

1.2.3 ELISA法檢測(cè)

1.2.3.1 ELISA檢測(cè)步驟 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出。置于室溫(20～25℃)平衡60min左右，將酶標(biāo)物(凍干粉)、樣品稀釋液(5×)、清洗液(10×)配制成工作液，預(yù)先進(jìn)行編號(hào)，標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，從板上取下所需數(shù)量的微孔，在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在各樣品孔中加入50μL樣品溶液，立即在所有孔中加入100μL的酶標(biāo)物，輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板幾秒鐘，室溫下(20～25℃)溫浴10min;倒掉微孔中的液體，在所有微孔中加滿(mǎn)清洗液250～300μL，洗板3次，在吸水紙上拍打，徹底清除微孔中的殘留液和氣泡;清洗程序完成后，立即用微量移液器在每個(gè)微孔中加入100μL顯色劑，室溫下(20～25℃)顯色10min;每孔中加入100μL終止液，混勻在450nm下檢測(cè)吸光度，10min內(nèi)讀取。

1.2.3.2 ELISA結(jié)果計(jì)算 分別檢測(cè)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的平均吸光度，所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的平均吸光度B除以空白標(biāo)準(zhǔn)品的平均吸光度B0即B/B0，將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的B/B0值輸入試劑盒自帶的半對(duì)數(shù)系統(tǒng)處理軟件中，對(duì)應(yīng)于各自的克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品的濃度可以獲得一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(B/B0為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo))，將樣品的B/B0值輸入試劑盒自帶的半對(duì)數(shù)系統(tǒng)處理軟件中即可得出在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上對(duì)應(yīng)的克侖特羅濃度，乘以對(duì)應(yīng)的樣品稀釋倍數(shù)，即為樣品中克侖特羅實(shí)際殘留量。

1.2.4 LC-MS/MS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證實(shí)驗(yàn)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法具有干擾小、除去雜質(zhì)能力較高、靈敏度低、可靠性高的優(yōu)點(diǎn)。因此選用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法作為檢測(cè)克侖特羅的確證方法［11］。按照正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的方法處理牛血液樣品，先用 ELISA法進(jìn)行篩選，然后通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4.1 液相色譜條件 色譜柱:RIDA C18柱(150mm×2.1mm，5μm)，柱溫為 30℃;流動(dòng)相 A 相為0.1%甲酸甲醇溶液、B相為0.1%甲酸水溶液;流速:0.30mL/min;進(jìn)樣量:20μL。

1.2.4.2 質(zhì)譜條件 電離方式:ESI+;電離電壓:3.5kV;錐孔電壓:25V;離子源溫度:115℃;錐孔氣流速:50L/h;霧化溫度:320℃;霧化氣流速:750L/h;檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。

1.2.4.3 結(jié)果計(jì)算 以克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積Y為縱坐標(biāo)，以克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為X軸，分別測(cè)定質(zhì)量濃度為 0.0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg/L 的克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品溶液的響應(yīng)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程。將樣品的響應(yīng)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算出樣品對(duì)應(yīng)的克侖特羅質(zhì)量濃度，即為樣品中克侖特羅實(shí)際殘留量。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 血樣離心前放置時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響 由圖1可見(jiàn)，當(dāng)血樣放置30min離心按照ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，血樣中克侖特羅殘留濃度最低，血樣放置60、90、120、150min 離心進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果差異不顯著(p＞0.10)。血液放置未過(guò)夜條件下，與60、90、120min離心檢測(cè)的結(jié)果相比，放置150min離心檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。血液樣品放置4℃過(guò)夜后再離心，得到的血清樣品透明清澈，檢測(cè)結(jié)果差異不顯著(p＞0.10)，與離心前放置30min后檢測(cè)的結(jié)果基本保持一致，從圖中的變化趨勢(shì)可見(jiàn)血液樣品離心前放置時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果有一定影響。

圖1 血液離心前放置時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響Fig.1 Effect of standing time of blood sample before centrifugation on test results

在規(guī)?；钆Ｍ涝咨a(chǎn)實(shí)踐中采集到血液樣品不可能立即進(jìn)行離心檢測(cè)，采集后的血液經(jīng)放置一段時(shí)間離心有利于提高血清樣品的質(zhì)量，血液未開(kāi)始凝固或凝固不完全時(shí)就強(qiáng)行離心，此時(shí)分離的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，進(jìn)行ELISA檢測(cè)時(shí)，容易造成假陽(yáng)性結(jié)果，所以為確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，血液樣品采集后應(yīng)放置適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后再進(jìn)行離心。如果離心后的血清樣品出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有類(lèi)過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，其作用與辣根過(guò)氧化物酶類(lèi)似，如果反應(yīng)孔非特異吸附類(lèi)過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，則可催化底物顯色加深，容易造成假陽(yáng)性［12］。溶血現(xiàn)象在超微量、高精度檢測(cè)分析中顯然不可忽視，因此，控制樣品離心前放置時(shí)間，減少溶血是保證檢驗(yàn)質(zhì)量的重要因素。龍憲和等［13］研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在健康人還是乙型肝炎病毒感染者中，溶血均導(dǎo)致ELISA一步法檢測(cè)HBsA假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)所采用的檢測(cè)試劑盒為一步法檢測(cè)，如果處理不當(dāng)很可能會(huì)出現(xiàn)溶血樣品檢測(cè)假陽(yáng)性的結(jié)果。

2.1.2 血樣離心后放置時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響 由圖2可見(jiàn)，隨著血清樣品放置時(shí)間的延長(zhǎng)，60、90、120min時(shí)檢測(cè)結(jié)果呈上升趨勢(shì)，120min時(shí)檢測(cè)結(jié)果最高，隨后檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，血樣離心后即刻檢測(cè)、離心后放置60min、離心后放置150min及4℃過(guò)夜保存，克侖特羅檢測(cè)結(jié)果差異不顯著(p＞0.10)。

圖2 血液離心后放置時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響Fig.2 Effect of standing time of blood sample after centrifugation on test results

2.1.3 血樣中抗凝劑添加比例對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響由圖3可見(jiàn)，隨著血液樣品中抗凝劑添加比例的增加，檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。血液離心后直接檢測(cè)和離心后放置4℃冰箱過(guò)夜保存后檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果變化不明顯，只是抗凝劑添加比例1∶9時(shí)檢測(cè)結(jié)果有差異，即4℃冰箱過(guò)夜保存比離心后直接檢測(cè)結(jié)果偏低。添加抗凝劑離心分離的血清均比未添加抗凝劑分離的血清清澈透明，血液樣品中添加抗凝劑，有利于提高離心后血清質(zhì)量，從而保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確。

圖3 血液中抗凝劑添加比例對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響Fig.3 Effect of proportion of added anticoagulants in blood on test results

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

2.2.2 直觀(guān)分析和方差分析 從表2、表3的直觀(guān)分析可知，各因素的最好水平為A2B1C2;比較各因素的極差可以看出，各因素對(duì)克侖特羅殘留檢測(cè)結(jié)果的影響，依程度排序?yàn)锳＞C＞B。A之所以影響最大，很可能是因?yàn)檠悍胖貌煌瑫r(shí)間后離心得到的血清質(zhì)量不同所致。

通過(guò)表 4 方差分析可知，F(xiàn)A＞F0.95(2，2)=19.0，F(xiàn)C＞ F0.90(2，2)=9.0，F(xiàn)B＜ F0.90(2，2)=9.0，說(shuō)明 A、C 兩因素分別在顯著水平0.05、0.10上差異顯著，B因素差異不顯著，與直觀(guān)分析的結(jié)果一致。因此提高克侖特羅殘留檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的最佳血液樣品前處理?xiàng)l件是A2B1C2，即離心前放置30min、離心后放置時(shí)間0min、抗凝劑添加比例為 1∶9。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal array design experiment results

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀(guān)分析Table 3 Intuitive analysis for Clenbuterol residues with various factors

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis for Clenbuterol residues with various factors

2.3 確證實(shí)驗(yàn)

采用ELISA法按照優(yōu)化的血液樣品前處理?xiàng)l件對(duì)30份牛血液樣品進(jìn)行檢測(cè)，并用LC-MS/MS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。

分別配制質(zhì)量濃度2.0、4.0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在全掃描方式下進(jìn)樣，調(diào)節(jié)電離源各個(gè)參數(shù)得到較強(qiáng)的［M+H］峰。在該條件下，對(duì)確定的母離子m/z277.100行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)，確定定量離子m/z 203.001，克侖特羅的離子流色譜圖，見(jiàn)圖4。

2.3.1 ELISA法檢測(cè)靈敏度 同時(shí)測(cè)定50份空白牛血清樣品的吸光度，按照1.2.3.2得出對(duì)應(yīng)于吸光度的血清樣品的濃度。檢測(cè)限y=ˉx+3s(ˉx為50份空白樣品濃度的平均值，s為50份空白樣品濃度的標(biāo)準(zhǔn)差)，ELISA法檢測(cè)牛血清樣品的檢測(cè)限為0.081μg/L，ELISA 試劑盒在 0.1～8.1μg/L 范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系。

2.3.2 LC-MS/MS 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 取 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg/L的克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)LC-MS/MS分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果表明克侖特羅在0.25～4.0μg/L范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，當(dāng)以克侖特羅的峰面積和克侖特羅質(zhì)量濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到克侖特羅線(xiàn)性方程為y=60923.8x+1800.03，相關(guān)系數(shù)R2=0.9981。

圖4 克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.4 Chromatogram of 2、4μg/L standard clenbuterol

圖5 克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.5 Standard curves of Clenbuterol

2.3.3 樣品的分析檢測(cè)結(jié)果 采用ELISA法按照優(yōu)化的血液樣品前處理?xiàng)l件對(duì)30份牛血液樣品中克侖特侖殘留進(jìn)行檢測(cè)，篩選出2份陽(yáng)性樣品(結(jié)果超過(guò)1.0μg/L)，結(jié)合 ELISA 試劑盒在 0.1～8.1μg/L 范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，確定在1.0～8.1μg/L線(xiàn)性范圍內(nèi)，ELISA檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。用LC-MS/MS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)，確證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在1.0～8.1μg/L線(xiàn)性范圍內(nèi)，ELISA法檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性率為0%。結(jié)果見(jiàn)表5，陽(yáng)性樣品的LC-MS/MS測(cè)定的質(zhì)量色譜圖如圖6所示。

表5 樣品的ELISA法和LC-MS/MS法檢測(cè)結(jié)果比較(μg/L)Table 5 Comparison of clenbuterol residues in positive samples determined by ELISA and LC-MS/MS(μg/L)

3 結(jié)論

通過(guò)控制血液離心前放置時(shí)間、離心后放置時(shí)間、抗凝劑添加比例，可以有效提高血清樣品的質(zhì)量，最大程度的減少ELISA法檢測(cè)牛血液樣品中克侖特羅殘留量假陽(yáng)性的結(jié)果。分析前牛血液樣品處理的各因素對(duì)克侖特羅殘留檢測(cè)結(jié)果的影響程度為:離心前放置時(shí)間＞抗凝劑添加比例＞離心后放置時(shí)間，牛血液樣品最佳前處理?xiàng)l件為離心前放置30min、抗凝劑添加比例為 1∶9、離心后放置時(shí)間0min。

圖6 克侖特羅陽(yáng)性樣品的色譜圖Fig.6 Chromatogram of positive clenbuterol samples

按照牛血液樣品最佳前處理?xiàng)l件，用ELISA法檢測(cè)30份樣品和用LC-MS/MS確證實(shí)驗(yàn)得出:在1.0～8.1μg/L線(xiàn)性范圍內(nèi)，ELISA法檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性率為0%。

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