盧 楠，毛 愷，廖鮮艷，翁新楚，宋紅生，黃俊逸

（上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200444）

自由基衰老學(xué)說指出人類衰老主要是由于自由基造成的[1]。D-半乳糖衰老動物模型自1985年提出以來，已應(yīng)用于模擬自然衰老小鼠或大鼠的腦[2-4]和肝[5-7]氧化損傷模型。D-半乳糖是一種還原性糖，在一定范圍內(nèi)可以被機體代謝。然而，高濃度的D-半乳糖在半乳糖氧化酶的作用下轉(zhuǎn)化成醛糖和過氧化氫物，進(jìn)而導(dǎo)致氧自由基增多[8]，自由基的氧化積累會損傷細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜脂質(zhì)等大分子，致使機體逐漸衰老。此外，D-半乳糖能與氨基酸的氨基反應(yīng)生成糖基化終產(chǎn)物（AGE），AGE會增加異常的氧化磷酸化，增加氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激的增加將引起線粒體、神經(jīng)損傷，進(jìn)一步使得認(rèn)知能力下降和壽命縮短[9]?？寡趸钚噪氖亲罱粡V泛研究的一類天然活性肽，抗氧化活性肽如小麥胚活性肽[10]、花生抗氧化肽[11]、雞骨膠原蛋白肽[12]等在D-半乳糖衰老動物模型體內(nèi)都表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。研究表明蠶蛹蛋白具有很好的營養(yǎng)價值和生理功效[13]。但是，長期以來，我國的蠶蛹加工利用率極低，除少數(shù)經(jīng)烘干粉碎作為營養(yǎng)添加劑外，多數(shù)用作飼料甚至肥料，還有很多被廢棄，造成資源的巨大浪費。已有研究通過飼喂幼鼠實驗表明蠶蛹多肽具有抗腫瘤[14]，降低血清膽固醇作用和抗氧化作用[15]。通過環(huán)磷酰胺造免疫力低下模型表明蠶蛹多肽溶液能提高免疫低下小鼠的免疫器官重量和外周血白細(xì)胞數(shù)[16]。然而，有關(guān)蠶蛹多肽對D-半乳糖衰老小鼠的抗氧化生理功效未見有報道。本實驗通過研究經(jīng)堿性蛋白酶Alcalase 2.4L酶解脫脂蠶蛹制得的蠶蛹多肽對D-半乳糖衰老模型小鼠抗氧化作用，以期為蠶蛹多肽在理論及實踐上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干蠶蛹 安徽省霍山縣絲綢廠；昆明種小鼠90只，雌雄各半，重量30～32g，1月齡 上海斯萊克實驗動物有限公司；堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L FG（根據(jù)SB/T 10317-1999測得酶活為124000U/mL）諾維信（中國）投資有限公司；D-半乳糖（D-gal）中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；過氧化氫酶（CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)試劑盒 南京建成生物工程中心；谷胱甘肽（GSH）沃凱有限公司；百福美魚膠原蛋白粉 海南華研生物科技公司；其他試劑 均為分析純，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。

MP200B型電子分析天平 上海億測電子設(shè)備有限公司；KX-21N型血常規(guī)分析儀 希森美康醫(yī)用電子有限公司；灌胃針、手術(shù)剪、手術(shù)鑷 上海艾研生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蠶蛹多肽的制備 干蠶蛹索氏抽提油脂得蠶蛹蛋白（蛋白含量94%），蠶蛹蛋白的酶解條件為底物濃度5%，pH8.30，Alcalase 2.4L堿性蛋白酶加酶量190200U/L，溫度50.47℃，時間2.45h，經(jīng)過甲醛滴定法測得水解度DH為18.5%，冷凍干燥即得蠶蛹多肽。

1.2.2 動物分組及喂養(yǎng) 實驗小鼠飼養(yǎng)溫度為18～22℃，自然光照，自由采食和飲水。實驗前將90只小鼠在實驗環(huán)境下給予基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)至3月齡，按體重隨機分成9組，分別是正常對照組（N），模型對照組（Mod），蠶蛹多肽低、中、劑量組（SPP-L、SPP-M、SPP-H），蠶蛹蛋白組（Pro），谷胱甘肽組（GSH），VC組，魚膠原蛋白組（Fish）。除N組外，其余8組腹腔注射600mg/（kg bw·d）D-半乳糖，同時SPP-L、SPP-M、SPP-H組分別按200、600、1000mg/（kg bw·d）的劑量灌胃蠶蛹多肽，Pro組灌胃930mg/（kg bw·d）劑量的蠶蛹蛋白，GSH組灌胃150mg/（kg bw·d）劑量的GSH，VC組灌胃10mg/（kg bw·d）劑量的VC，F(xiàn)ish組灌胃600mg/（kg bw·d）劑量的魚膠原蛋白肽。N組注射等體積生理鹽水，灌胃等體積的蒸餾水，每隔3d稱量一次，調(diào)整灌胃量，實驗持續(xù)42d。

1.2.3 抗氧化指標(biāo)的測定 實驗?zāi)┤战?2h后摘眼球采血，頸椎脫臼處死，稱取0.1～0.2g腦組織和肝臟，加入9倍體積的生理鹽水，于勻漿器中制成10%的組織勻漿液，3000r/min離心10min，取上清液備用。腦組織與肝組織中T-AOC、CAT、SOD、GSH-Px活性和MDA含量的測定采用試劑盒進(jìn)行測定。

1.2.4 免疫能力的測定 將待測各組小鼠脫頸椎處死，稱體重，解剖去胸腺及脾臟，用電子天秤桿精密稱取濕重，計算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。小鼠胸腺或脾指數(shù)=胸腺或脾重量（mg）/體重（g）。小鼠摘眼球取血約1mL，置于含EDTAK2、EDTAK3抗凝劑的血常規(guī)管中，血液分析儀檢測小鼠WBC數(shù)目。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用平均數(shù)X±標(biāo)準(zhǔn)偏差SD（±SD）以及百分?jǐn)?shù)表示，各組數(shù)據(jù)均數(shù)間用t檢驗判斷其差異顯著性。p＜0.05為顯著性差異，p＜0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPP對衰老小鼠腦組織和肝組織中CAT、SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA含量的影響

由表1和表2可知，與實驗組比較，Mod組腦和肝組織中MDA含量的升高和CAT、SOD、GSH-Px、TAOC活力的降低均呈極顯著（p＜0.01）。而SPP各組腦和肝組織中CAT、SOD、GSH-Px、T-AOC活力與Mod相比均有不同程度地提高，SPP-H組提高顯著（p＜0.01或p＜0.05）。同時腦組織MDA分別從Mod組13.36nmol/mg prot降為SPP-L、SPP-M、SPP-H組13.33、12.65、10.47nmol/mg prot，肝組織中MDA分別從Mod組9.98nmol/mg prot降為SPP-L、SPP-M、SPP-H組9.75、8.64、8.15nmol/mg prot。

其中與衰老模型組相比，SPP-H組顯著降低MDA含量，顯著提高CAT、SOD、GSH-Px和T-AOC活力（p＜0.01或p＜0.05），表明SPP對動物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物的生成有較強抑制作用，可能是由于SPP中疏水性氨基酸可使抗氧化肽與脂肪酸之間的相互作用增強，提高其對自由基的捕捉能力[17]，或者SPP中存在螯合催化脂質(zhì)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的金屬離子，從而能夠較強地抑制機體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化，在一定程度上延緩衰老，起到抗氧化的功效[18]。SPP的抗氧化結(jié)果與文獻(xiàn)報道的小麥胚活性肽[10]與乳清蛋白肽[11]對D-gal致衰老小鼠的影響效果一致。

陽性對照Pro組以酶解得到SPP-M組相同劑量灌胃，與Mod組比較，Pro組能略微提高CAT、SOD和TAOC含量，說明SPP具有比蠶蛹蛋白更高的抗氧化活性，因為蛋白通過水解才能釋放出一些活性肽類，抗氧化肽的抗氧化性與肽中含有的某些可與自由基反應(yīng)的特殊基團(tuán)有關(guān)，即供氫基團(tuán)，只有當(dāng)這些肽在適當(dāng)分子量時，這些特殊的供氫基團(tuán)才能得到最大的暴露而與自由基充分作用，表現(xiàn)出較強的抗氧化活性[19]。VC和GSH都是市場上常用的抗氧化保健物質(zhì)，陽性對照VC和GSH組以與SPP-M組相同體外還原力的劑量灌胃，結(jié)果表明SPP組的抗氧化效果與GSH和VC相當(dāng)。魚膠原蛋白肽是近年市場熱銷的抗氧化產(chǎn)品，通過水解深海魚類膠原蛋白得到純度較高分子量較小的抗氧化肽，具有延緩皮膚衰老、增強記憶力等功效[20]。陽性對照Fish組以與SPP-M組相同劑量灌胃，結(jié)果表明，SPP-M、SPP-H組的抗氧化作用高于Fish組。

表1 小鼠腦組織抗氧化能力（X±S）Table 1 The antioxidation function of brain（±S）

表1 小鼠腦組織抗氧化能力（X±S）Table 1 The antioxidation function of brain（±S）

注：#：表示與N組相比較，p<0.05；##：表示與N組相比較，p<0.01；*：表示與Mod組相比較，p<0.05；**表示與Mod組相比較，p<0.01；n=10；表2～表3同。

組別 MDA（nmol/mg prot） CAT（U/mg prot）SOD（U/mg prot）GSH-Px（U）T-AOC（U/mg prot）N組 8.92±1.31 16.43±2.19 153.32±7.31 84.56±7.76 3.31±0.48 Mod組 13.36±2.14## 12.64±1.14## 130.44±10.51## 71.07±7.48## 2.01±0.24##SPP-L組 13.33±2.34 12.13±1.19 127.75±7.29 74.55±7.82* 2.19±1.26 SPP-M組 12.65±3.46 15.67±0.51** 134.41±13.77* 81.43±4.95** 2.31±0.44 SPP-H組 10.47±1.65** 15.99±1.29** 148.65±16.74** 77.38±6.72** 2.98±0.72**Pro組 12.63±3.13 12.36±1.11 129.77±14.69 74.57±6.43* 2.41±0.55 GSH組 10.77±2.22** 16.08±2.75** 144.53±9.27** 78.64±4.63** 2.71±0.40*VC組 11.64±3.15* 16.05±1.56** 145.36±16.49** 74.53±7.67* 2.58±0.62 Fish組 12.06±2.58 14.73±2.40** 130.28±14.64 75.28±8.83** 2.67±0.74

表2 小鼠肝臟抗氧化能力（X±S）Table 2 The antioxidation function of liver（±S）

表2 小鼠肝臟抗氧化能力（X±S）Table 2 The antioxidation function of liver（±S）

組別 MDA（nmol/mg prot） CAT（U/mg prot）SOD（U/mg prot）GSH-Px（U）T-AOC（U/mg prot）N組 7.58±1.10 112.38±8.41 111.28±7.41 92.25±8.57 3.04±0.68 Mod組 9.98±2.05## 64.46±6.61## 82.46±14.12## 80.50±6.44## 1.70±0.74##SPP-L組 9.75±1.06 89.41±9.79* 100.31±5.46* 80.31±7.44 2.54±0.65 SPP-M組 8.64±1.15* 96.36±7.41** 108.38±11.38** 89.32±6.62** 2.51±0.53*SPP-H組 8.15±1.10** 100.94±8.85** 108.54±12.26** 90.28±9.35** 2.60±0.73*Pro組 9.71±0.94 74.51±10.42 90.49±7.47 83.85±7.55* 2.55±0.57*GSH組 8.56±1.12* 101.30±13.78** 106.56±21.94** 85.54±6.38** 2.78±0.88*VC組 8.64±0.95* 94.23±2.13* 101.60±14.29* 87.42±9.45** 2.63±0.95*Fish組 8.77±1.07 92.24±3.44* 107.66±14.54** 82.62±7.65 2.61±0.79*

在一定時間內(nèi)連續(xù)給小鼠注射大劑量D-gal后，機體會產(chǎn)生過量的H2O2、·OH和O2－·等自由基，使體內(nèi)的SOD和GSH-Px等活性降低，從而使機體的抗氧化水平降低，生物膜脂質(zhì)過氧化，最終引起亞急性衰老，其中腦衰老出現(xiàn)的最早[10]。已有研究表明氧自由基造成神經(jīng)元壞死從而導(dǎo)致一系列的神經(jīng)性疾病，如阿爾茨海默病和帕金森病[21]。而抗氧化劑能通過緩解氧化損傷，提高腦部抗氧化防御體系，從而提高學(xué)習(xí)記憶能力[22]。肝臟是機體最主要的排毒器官，它具有較高的代謝率，自由基的累積會造成肝損傷，肝臟抗氧化防御體系的完整性對健康非常重要[23]?？寡趸瘎┠芡ㄟ^抑制caspase-3活性和增強PI3K/Akt通路來減少肝細(xì)胞凋亡[6]。結(jié)果表明，通過SPP的攝入，衰老小鼠的腦組織與肝臟均不同程度減緩了氧化損傷，并呈一定劑量依賴性，由此可見，SPP是一種良好的抵抗機體衰老的抗氧化活性物。

2.2 SPP對衰老小鼠免疫器官重量和外周血白細(xì)胞數(shù)（WBC）的影響

脾臟和胸腺是機體兩大免疫器官，其在機體的免疫調(diào)節(jié)和免疫因子分泌上必不可缺。血液白細(xì)胞則是機體主要的免疫活性細(xì)胞在抵御病原的入侵和對疾病的免疫方面起著重要作用。如表3所示，在調(diào)節(jié)衰老小鼠的免疫器官指數(shù)和血液免疫細(xì)胞數(shù)上，與衰老模型組相比，SPP各組免疫器官指數(shù)和WBC均有不同程度地提高，SPP-H組提高極顯著（p＜0.01）。與文獻(xiàn)中報道的大豆肽對免疫低下小鼠的作用效果一致[24]。對于衰老模型小鼠，小鼠機體調(diào)控系統(tǒng)能夠積極反應(yīng)起來，緩解小鼠急劇免疫力低下的異常狀況，此時配合SPP的攝入，可以發(fā)現(xiàn)SPP可減輕小鼠的免疫機能衰弱現(xiàn)象，特別是SPP-H組提高免疫能力相當(dāng)于GSH組，顯著改善小鼠胸腺和脾臟萎縮以及血液白細(xì)胞數(shù)減少癥，體現(xiàn)出SPP作為提高機體免疫力保健品的開發(fā)價值。

表3 小鼠免疫指標(biāo)（±S）Table 3 The immune function in different groups（S）

表3 小鼠免疫指標(biāo)（±S）Table 3 The immune function in different groups（S）

外周白細(xì)胞數(shù)（×109/L）N組 3.08±0.09 2.17±0.14 7.83±0.28 Mod組 2.30±0.13## 1.67±0.13## 6.41±0.18##SPP-L組 2.70±0.12* 1.98±0.24 7.00±0.21*SPP-M組 2.75±0.13* 2.03±0.13 7.02±0.35*SPP-H組 2.79±0.08** 2.24±0.16** 7.20±0.32**Pro組 2.64±0.12 1.96±0.05 6.64±0.23 GSH組 2.88±0.14** 2.08±0.12* 7.12±0.28**VC組 2.77±0.15* 2.05±0.13* 7.00±0.19**Fish組 2.62±0.17 2.06±0.14* 6.93±0.16*組別 脾臟指數(shù)（mg/g）胸腺指數(shù)（mg/g）

3 結(jié)論

灌胃中、高劑量的SPP后，與Mod組相比，小鼠腦組織和肝臟的MDA的含量顯著降低（p＜0.05或p＜0.01），而CAT、SOD、GSH-Px和T-AOC顯著提高（p＜0.05或p＜0.01）。因而SPP能提高衰老小鼠的抗氧化水平，并呈一定的劑量相關(guān)性。

SPP-M、SPP-H組在調(diào)節(jié)衰老小鼠的免疫器官指數(shù)和血液免疫細(xì)胞數(shù)上效果顯著（p＜0.05或p＜0.01）。對于衰老模型小鼠，小鼠機體調(diào)控系統(tǒng)能夠積極反應(yīng)起來，緩解小鼠的免疫機能衰弱狀況。

與陽性對照蠶蛹蛋白組和魚膠原蛋白肽組相比，SPP表現(xiàn)更強的減緩小鼠衰老的作用，SPP-H組對小鼠抗衰老作用相當(dāng)于等體外抗氧化效果的谷胱甘肽組，體現(xiàn)出SPP作為抗氧化保健品的開發(fā)價值。

[1]Harman D.Free radical theory of ageing：Applications[J].The Asia Pacific Heart Journal，1998，7（3）：169-177.

[2]Li W J，Nie S P，Xie M Y，et al.Ganoderma atrum polysaccharide attenuates oxidative stress induced by d-galactose in mouse brain[J].Life Sciences，2011，88（15-16）：713-718.

[3]Zhong S Z，Ge Q H，Qu R，et al.Paeonol attenuates neurotoxicity and ameliorates cognitive impairment induced by d-galactose in ICR mice[J].Journal of the Neurological Sciences，2009，277（1-2）：58-64.

[4]Lu J，Zheng Y L，Wu D M，et al.Ursolic acid ameliorates cognition deficits and attenuates oxidative damage in the brain ofsenescent mice induced byd-galactose[J].Biochemical Pharmacology，2007，74（7）：1078-1090.

[5]Zhang Z F，F(xiàn)an S H，Zheng Y L，et al.Purple sweet potato color attenuates oxidative stress and inflammatory response induced by d-galactose in mouse liver[J].Food and Chemical Toxicology，2009，47（2）：496-501.

[6]Zhang Z F，Lu J，Zheng Y L，et al.Purple sweet potato color protects mouse liver against d-galactose-induced apoptosis via inhibiting caspase-3 activation and enhancing PI3K/Akt pathway[J].Food and Chemical Toxicology，2010，48（8-9）：2500-2507.

[7]Wills P J，Asha V V.Protective effect of Lygodium flexuosum（L.）Sw.（Lygodiaceae）against d-galactosamine induced liver injury in rats[J].Journal of Ethnopharmacology，2006，108（1）：116-123.

[8]Song X，Bao M，Li D，et al.Advanced glycation in D-galactose induced mouse aging model[J].Mechanisms of Ageing and Development，1999，108（3）：239-251.

[9]許揚，吳濤，顧佳黎，等.D-半乳糖誘導(dǎo)衰老動物模型研究進(jìn)展[J].中國老年學(xué)雜志，2009，29（13）：1710-1713.

[10]陳英，朱科學(xué)，彭偉，等.小麥胚活性肽對D-半乳糖衰老模型小鼠抗氧化作用研究[J].食品科學(xué)，2010，31（19）：325-328.

[11]包怡紅，李銳達(dá)，梁雪，等.乳清蛋白肽對衰老小鼠抗氧化能力的影響[J].營養(yǎng)學(xué)報，2010，32（3）：239-241.

[12]張根生，符群，岳曉霞.雞骨膠原蛋白肽對D-半乳糖致衰小鼠抗氧化性的研究[J].食品工業(yè)科技，2010，31（1）：361-363.

[13]Longvah T，Mangthya K，Ramulu P.Nutrient composition and protein quality evaluation of eri silkworm（Samia ricinii）prepupae and pupae[J].Food Chemistry，2011，128（2）：400-403.

[14]閆琦濤，曹柏營，昌友權(quán)，等.蠶蛹蛋白多肽液抗腫瘤作用的實驗研究[J].食品科學(xué)，2008，29（11）：588-590.

[15]周菊香，熊燕飛，韓志紅，等.蠶蛹多肽保健功能的研究[J].武漢市職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2001，29（3）：4-5.

[16]劉雋彥，陶秋萍，孫繼紅，等.柞蠶蛹多肽溶液對小鼠免疫影響的研究[J].北方蠶業(yè)，2010，31（2）：10-12.

[17]Rajapakse N，Mendis E，Jung W K，et al.Purification of a radical scavenging peptide from fermented mussel sauce and its antioxidant properties[J].Food Research International，2005，38：175-182.

[18]Suetsuna K，Ukeda H，Ochi H.Isolation and characterization of free radical scavenging activities peptides derived from casein[J].Journal of Nutritional Biochemistry，2000（11）：128-131.

[19]Sarmadi B H，Ismail A.Antioxidative peptides from food proteins：A review[J].Peptides，2010，31（10）：1949-1956.

[20]Midori T，Yoh-ichi K，Yoshihiro N.Effects of collagen peptide ingestion on UV-B-Induced skin damage[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2009，73（4）：930-932.

[21]Opii W O，Joshi G，Head E，et al.Proteomic identification of brain proteins in the canine model of human aging following a long-term treatmentwith antioxidantsand a program of behavioral enrichment：Relevance to Alzheimer’s disease[J].Neurobiology of Aging，2008，29（1）：51-70.

[22]Head E，Nukala V N，F(xiàn)enoglio K A，et al.Effects of age，dietary，and behavioral enrichment on brain mitochondria in a canine model of human aging[J].Experimental Neurology，2009，220（1）：171-176.

[23]Albano E.Free radical mechanisms in immune reactions associated with alcoholic liver disease[J].Free Radical Biology and Medicine，2002，32（2）：110-114

[24]國明明，華欲飛.大豆肽免疫調(diào)節(jié)作用的研究[J].食品科技，2007，32（7）：242-244.