李 藝，孟 鎮(zhèn)，鐘其頂，仇 凱，熊正河，*，欒同青，3，張澤生

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027；3.山東輕工業(yè)學(xué)院，山東濟南250353）

抗生素使用不當(dāng)已成為引起腸道菌群失調(diào)的最常見誘因[1]，抗生素在抑制或殺死致病菌的同時，也常同時損傷正常菌群，造成不同程度的菌群失調(diào)。近年來，越來越多的研究表明，益生菌產(chǎn)品能有效預(yù)防和治療抗生素引起的菌群失調(diào)。植物乳桿菌作為益生菌中重要的一個成員其調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)的作用已經(jīng)被證明，并廣泛用于乳品、藥品及果蔬類產(chǎn)品的發(fā)酵[2-3]。

植物乳桿菌對腸道菌群作用效應(yīng)本質(zhì)上為腸道微生態(tài)區(qū)系的變化。立足于微生態(tài)學(xué)觀點，研究植物乳桿菌對腸道菌群的調(diào)節(jié)及腸道菌群的演替，對植物乳桿菌功能的研究具有重要的意義。腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)十分復(fù)雜，腸道中絕大多數(shù)微生物的生長需要厭氧環(huán)境，而目前的厭氧培養(yǎng)技術(shù)不足以觀察腸道菌群的多態(tài)性及動態(tài)變化。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為研究動物腸道微生態(tài)提供了簡便而快捷的方法[4-5]。其中DGGE技術(shù)近年來逐漸被應(yīng)用于檢測動物胃腸道主要細(xì)菌類群的多態(tài)性[6-9]，從而更加全面準(zhǔn)確地反映復(fù)雜腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)多樣性。

目前，關(guān)于植物乳桿菌對腸道菌群失調(diào)作用的評價仍然很大程度上依賴選擇性培養(yǎng)方式[10-11]，并且大多數(shù)研究比較集中于益生菌的作用效果上[10-12]。而有關(guān)益生菌調(diào)節(jié)過程中腸道菌群的整體變化的研究鮮有報道，這些信息的缺失使菌群整體性變化的研究無法展開，成為揭示腸道菌群演替與各種病理狀態(tài)關(guān)系的瓶頸。本研究利用DGGE技術(shù)研究植物乳桿菌對抗生素相關(guān)性腸道菌群失調(diào)的調(diào)整過程，研究抗生素、植物乳桿菌與腸道菌群變化的關(guān)系，并對頭孢地尼的耐藥菌株及抗生素相關(guān)性腹瀉的致病菌進行初步研究。為進一步研究益生菌作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌 昂立公司；昆明小鼠，雌性，體重（18±2）g 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心；乳桿菌選擇性培養(yǎng)基（MRS）、伊紅美藍培養(yǎng)基（EMB）、腸球菌瓊脂、腦心浸液瓊脂（BHI）北京陸橋技術(shù)有限公司；引物F338GC/R518、F338/R518、M13F/M13R、dNTPs、X-gal、IPTG 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；TransTaqTM HiFi DNA Polymerase、DNA純化試劑盒、pEASY-T3 Cloning Kit、Trans1-T1 北京全式金生物科技有限公司；溶菌酶、蛋白酶K、SDS 北京全新拓達科技有限公司；去離子甲酰胺、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、N，N，N’，N’-四甲基二乙胺 Sigma公司。

恒溫生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；高速冷凍離心機 Sigma公司；梯度PCR儀 Biometra公司；水平電泳儀 北京六一儀器廠；凝膠成像儀 Vilber lourmat公司；變性梯度凝膠電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及菌群失調(diào)模型的建立 小鼠20只，靜養(yǎng)1d適應(yīng)環(huán)境后，按體重隨機分為兩組，即正常對照組、植物乳桿菌治療組，每組各10只，單獨喂養(yǎng)。正常對照組灌胃生理鹽水；植物乳桿菌治療組灌50mg/mL頭孢地尼水溶液0.2mL/次，每天2次，時間間隔6h，連續(xù)5d后，收集糞便做腸道菌群分析。之后，植物乳桿菌治療組灌胃植物乳桿菌溶液（109CFU/mL），連續(xù)5d，每天收集糞便樣品。

1.2.2 小鼠糞便活菌計數(shù) 無菌稱取小鼠糞便，經(jīng)10倍倍比稀釋后，選擇合適濃度在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)計數(shù)，每個濃度重復(fù)3次。以下培養(yǎng)基用于活菌計數(shù)檢測：BHI Agar用于厭氧總菌培養(yǎng)；MRS用于乳桿菌的選擇培養(yǎng)；BSM由MRS添加0.05%（w/v）鹽酸半胱氨酸及0.05%（w/v）莫匹羅星后制得，用于雙歧桿菌的選擇培養(yǎng)；腸球菌瓊脂培養(yǎng)基用于腸球菌培養(yǎng)；EMB培養(yǎng)基用于兼性厭氧腸桿菌培養(yǎng)。BHI平板、MRS平板及BSM平板置于37℃厭氧條件下培養(yǎng)48h后計數(shù)；腸球菌瓊脂平板、EMB平板置于37℃有氧條件下培養(yǎng)24h后計數(shù)，數(shù)據(jù)以CFU/g表示。

1.2.3 小鼠糞便DNA的提取及PCR擴增 糞便菌群總DNA的提取方法參見文獻[13]。提取的DNA通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其DNA完整性。以16S rDNA可變區(qū)V3區(qū)為靶標(biāo)，進行PCR擴增，上游引物：F338-GC：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC GGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，下劃線部分為GC夾；下游引物R518：5’-ATTAC CGCGGCTGCTGG-3’PCR反應(yīng)體系為：總反應(yīng)體積為50μL，其中包括10×Buffer（Mg2+）5μL，10mmol/L dNTP混合液1μL，10mmol/L引物各1μL，模板1μL，Taq酶0.3μL，加雙蒸水ddH2O至50μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸7min。PCR擴增產(chǎn)物5μL加3μL的溴酚藍，混勻，用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，恒壓80V 1h，EB染色15min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下成像，保存圖譜。

1.2.4 DGGE電泳及染色 參照Muyzer等[14]方法，對16S rDNA V3可變區(qū)序列的擴增產(chǎn)物進行DGGE分析。DGGE使用8%聚丙烯酰胺凝膠，將100%變性梯度定義為含40%（v/v）甲酰胺和7mol/L尿素，變性梯度為30%～60%，電泳條件如下：60℃20V電壓下預(yù)電泳30min，隨后在60V的固定電壓下電泳16h。電泳結(jié)束后，進行EB染色。DGGE凝膠切膠并采用Qantity One（Bio-Rad）進行相似性和多樣性分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，不同實驗組之間的差異分析采用Student—t檢驗，p＜0.05為差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義，p＜0.01為差異有極顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 糞便活菌計數(shù)

昆明雌性小鼠經(jīng)頭孢地尼灌胃處理5d后，乳桿菌和厭氧總菌明顯減少，而且未檢測到雙歧桿菌、腸球菌和腸桿菌，說明造模成功，如表1所示。

表1 小鼠糞便菌群檢測結(jié)果比較（lg CFU/g標(biāo)本，均值±SD）Table 1 The comparison of fecal microflora detection result（lg CFU/g sample,mean±SD）

2.2 靶標(biāo)16S DNA的V3區(qū)通用引物PCR-DGGE分析

小鼠糞便細(xì)菌的16S rDNA V3區(qū)的DGGE圖譜及聚類分析見圖1。圖1中不同位置的條帶代表不同的優(yōu)勢細(xì)菌，亮度反映出細(xì)菌相對量的多少?？股毓辔盖暗恼Ｐ∈笥写罅織l帶存在，說明正常的腸道存在大量的細(xì)菌，用其制備動物模型，對腸道菌群進行相關(guān)研究具備可行性。抗生素連續(xù)處理5d后DGGE圖譜顯示條帶數(shù)量顯著減少，說明長時間大量抗生素處理能夠殺滅腸道中的大部分細(xì)菌。

圖1 小鼠糞便細(xì)菌微生物區(qū)系16S rDNA V3區(qū)引物的DGGE圖譜Fig.1 DGGE profiles obtained with universal primers V3 of 16S rDNA of fecal microbiota

圖2 UPGMA相似性聚類分析Fig.2 UPGMA cluster analysis for similarity coefficients

DGGE圖譜中條帶的差別可以很好地反映出實驗過程中小鼠腸道細(xì)菌組成的差異與相同之處。本實驗中灌胃抗生素后（泳道2）的B、I條帶是特有條帶；植物乳桿菌治療組泳道A、D、G條帶，是灌胃植物乳桿菌后特有條帶。條帶L存在于各組的樣品中，為共有條帶，說明這個條帶所代表的細(xì)菌，可能對頭孢地尼具有一定的耐藥性。從DGGE圖譜整體可見，隨著植物乳桿菌灌胃時間的延長，條帶數(shù)目逐漸增多，說明腸道菌群的多樣性增加。在植物乳桿菌處理第4d腸道菌群結(jié)構(gòu)與正常小鼠基本一致。雖然灌胃植物乳桿菌可以使腸道菌群有所恢復(fù)，但與正常組小鼠的腸道菌群相比有些菌仍然無法恢復(fù)，如條帶K。泳道2中的條帶B是抗生素組中的優(yōu)勢條帶，其在灌胃益生菌初期存在，至灌胃第3d消失，該條帶所對應(yīng)的菌有可能是對腸道不利的菌，隨著灌胃時間延長，植物乳桿菌對該菌有抑制作用。由此可見，DGGE指紋圖譜帶型的差異，能很好地反映出抗生素與植物乳桿菌對小鼠腸道菌群的不同影響。

平均數(shù)進行非權(quán)重配對法（UPGMA）相似性聚類結(jié)果如圖2所示，更進一步證明了植物乳桿菌作用過程中DGGE圖譜的異同。結(jié)果顯示，灌胃植物乳桿菌過程第2d與第3d相似性系數(shù)77%；第4d與第5d相似性為86%；灌胃植物乳桿菌過程中各泳道聚為一族，與正常小鼠相比相似性為60%。

植物乳桿菌對腸道微生物菌群多樣性的分析見表2。頭孢地尼處理后條帶數(shù)明顯減少，即腸道菌群種類減少，經(jīng)結(jié)合細(xì)菌數(shù)量的多樣性指數(shù)分析，菌群多樣性減少。植物乳桿菌治療組與抗生素處理組相比，條帶數(shù)有所增加，但與小鼠灌胃前比較，條帶數(shù)和菌群多樣性仍存在差異，但考慮細(xì)菌數(shù)量的多樣性指數(shù)與灌胃前無顯著性差異，說明植物乳桿菌可以有效調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂。

2.3 DGGE圖譜對應(yīng)的腸道優(yōu)勢條帶DNA序列分析

表2 V3區(qū)引物DGGE圖譜的多樣性指數(shù)分析Table 2 Diversity indices analysis of the DGGE patterns generated from V3 regions

表3 DGGE代表條帶序列比對結(jié)果Table 3 Tentative identification of DGGE bands by sequencing the excised and Blast analysis

經(jīng)測序后，用Blast工具與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有序列進行比對，結(jié)果如表3所示。糞便中的細(xì)菌與數(shù)據(jù)庫中的已知細(xì)菌序列有很高的相似性，都在99%以上。L條帶在實驗過程中一直存在，說明該條帶所對應(yīng)的菌對頭孢地尼有耐藥性，而與L條帶同源性最高的是Clostridium clostridioforme（艱難梭菌）是梭菌屬的一種專性厭氧菌，一般寄生在人的腸道內(nèi)。艱難梭菌的菌群生長速度加快，影響腸道中其他細(xì)菌，引發(fā)炎癥。圖1中可以看出，在灌胃植物乳桿菌過程中，A條帶亮度是逐漸降低的，說明艱難梭菌隨著灌胃植物乳桿菌時間的延長其在腸道中的數(shù)量逐漸減少。

I條帶是灌胃抗生素后特有的條帶，與I條帶同源性最高的是Pseudomonas stutzeri（施氏假單胞菌），假單胞菌一般能天然抵抗多種抗菌藥物，并且本菌在使用抗菌藥物治療過程中易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性。因此，該菌在灌胃大量抗生素后仍然存在腸道中。

C、M條帶是在灌胃植物乳桿菌過程中一直存在的條帶，說明這兩個條帶對應(yīng)的細(xì)菌較容易恢復(fù)。與C條帶同源性最高的是Bacteroides stercoris（糞便擬桿菌），糞便菌群中的Bacteroides stercoris和結(jié)腸癌的高發(fā)病風(fēng)險有顯著相關(guān)性。由此可知該菌在腸道菌群中占有重要地位。與M條帶同源性最高的是Ruminococcus gauvreauii strain，該菌群為專性厭氧菌，是腸道中優(yōu)勢菌群。楊會玲等[15]研究合生素對肉仔雞腸道微生物區(qū)系的影響中也檢測到了Ruminococcus gauvreauii strain。

D條帶是在灌胃植物乳桿菌前兩天很明顯，隨后條帶亮度逐漸減弱。條帶D與Bacteroides acidifaciens strain相似性為100%，該菌代表生酸擬桿菌，李永洙[16]研究顯示不良雞群樣本中均檢測到Bacteroides屬的生酸擬桿菌（Bacteroides acidifaciens），該菌對機體生長發(fā)育不利。由此可見，植物乳桿菌對腸道菌群有很好的調(diào)節(jié)作用，抑制有害菌的生長。

F條帶是在灌胃植物乳桿菌后亮度逐漸增加的條帶，與F條帶同源性最高的是Bacteroides uniformis strain（單形擬桿菌），Queipo-Ortu?o MI等[17]研究紅酒多酚對人類腸道菌群的影響時發(fā)現(xiàn)連續(xù)四周每天攝入紅酒多酚后，Bacteroides uniformis strain數(shù)量明顯增加。

G條帶是正常小鼠沒有而灌胃植物乳桿菌的小鼠出現(xiàn)的特有條帶，說明該菌在腸道中較難恢復(fù)；與G條帶同源性最高的是Bacteroides graminisolvens strain。K條帶在灌胃結(jié)束后仍然無法恢復(fù)的特征條帶，與K條帶同源性最高的Bacteroides caccae strain（糞擬桿菌）。

3 結(jié)論

本文采用16S rDNA PCR-DGGE基因指紋分析技術(shù)，針對抗生素處理和植物乳桿菌治療過程中腸道菌群組成變化進行初步分析，探討植物乳桿菌對抗生素誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群失調(diào)的影響。實驗結(jié)果表明：大劑量頭孢地尼處理會導(dǎo)致小鼠腸道菌群發(fā)生紊亂，對頭孢地尼敏感的可培養(yǎng)厭氧總菌、乳桿菌、雙歧桿菌、腸球菌及腸桿菌數(shù)量下降99%以上，多樣性和定植抗力嚴(yán)重受損，說明本研究腸道菌群失調(diào)動物模型制備是有效的。而DGGE圖譜顯示，Mycoplasma sualvi strain、Clostridium proteolyticum strain兩株菌在抗生素處理結(jié)束后演替為優(yōu)勢菌群，說明這兩株菌是抗生素頭孢地尼的耐受菌及抗生素相關(guān)性菌群失調(diào)所導(dǎo)致臨床癥狀的致病菌。

隨著植物乳桿菌飼喂時間的延長，小鼠腸道菌群豐富度呈現(xiàn)逐漸增加的演替過程，至飼喂第4d腸道菌群多樣性與正常小鼠基本一致。對圖譜上獨有的和各組共有的條帶進行測序，測序結(jié)果表明植物乳桿菌調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群失調(diào)的作用主要表現(xiàn)在兩個方面：選擇性地增加有益菌如Bacteroides stercoris、Bacteroides uniformis strain等的量；抑制致病菌如Clostridium clostridioforme、Pseudomonas stutzeri等的生長。本研究為深入益生菌產(chǎn)品的開發(fā)以及進一步探討益生菌對腸道菌群的作用機制的研究提供了參考。

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