鄭 義，邵 穎，陳安徽，朱園園，張娜娜

（1.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇徐州221000；2.江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221000）

斑玉蕈（Hypsizigus marmorens），隸屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬，是一種珍稀藥食兼用菌。斑玉蕈提取物對S180腫瘤、MethA纖維肉瘤、Lewis肺癌、HepG2等腫瘤均有明顯的抑制作用[1-4]，還具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血脂等作用[5-6]。多糖是真菌的主要活性成分之一，目前已經(jīng)上市的真菌多糖類保健品有上百種，在臨床上正式應(yīng)用的有香菇多糖、云芝多糖和裂褶菌多糖等多種，而未見有以斑玉覃多糖為主要成分的藥品及保健品。目前有關(guān)斑玉覃多糖的提取主要以熱水（或堿液）浸提法為主[7-8]，存在費(fèi)時、耗能高、多糖活性損失較大等問題。酶輔助提取是近幾年發(fā)展起來的一種新技術(shù)，酶處理可以提高多糖的得率，同時保持多糖的構(gòu)象與生物活性[9]，目前尚未見應(yīng)用于斑玉覃多糖提取的報(bào)道。多糖提取率受到酶解溫度、pH、酶添加量等多種因素的影響，需要對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)采用酶輔助提取斑玉覃多糖，對提取工藝及抗氧化活性進(jìn)行研究，旨在為開發(fā)以斑玉覃多糖為主要成分的中藥及保健品提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

斑玉蕈子實(shí)體 江蘇徐州市售；木瓜蛋白酶（酶活≥100000U/g）、纖維素酶（酶活≥11000U/g）均為食品級，購自江蘇無錫；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）Sigma公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

TU-1810型紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；THZ-82型恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩 浙江上虞華美儀器紗篩廠；風(fēng)選中藥粉碎機(jī) 山東省青州市精誠機(jī)械制造有限公司；FA2104N型電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SENCO R201L型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；TGL-20M型高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶法提取斑玉蕈多糖 將新鮮斑玉蕈用清水洗凈，除去其根部，適當(dāng)切段于60℃干燥箱干燥，待斑玉蕈恒重，放入粉碎機(jī)中粉碎，過60目篩，干燥保存待用。準(zhǔn)確稱取2g斑玉蕈干粉，溶于一定體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，預(yù)熱至酶解溫度，加入一定量的復(fù)合酶（木瓜蛋白酶和纖維素酶按1∶1質(zhì)量比例配合），恒溫振蕩器中提取一定時間。提取結(jié)束后沸水浴滅酶10min，冷卻，減壓抽濾，濾液濃縮后在4℃下用70%乙醇沉析12h、離心，所得沉淀用無水乙醇洗滌3次，冷凍干燥后得斑玉蕈多糖。

1.2.2 多糖含量測定 多糖含量測定采用苯酚-硫酸法[10]。

多糖得率（%）=斑玉蕈多糖質(zhì)量/斑玉蕈干粉質(zhì)量×100。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 考察復(fù)合酶添加量（復(fù)合酶質(zhì)量占斑玉蕈粉質(zhì)量的百分比）、pH、酶解溫度、提取時間對多糖得率的影響，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.2.4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采取Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排四因素三水平實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素水平表如表1所示。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.2.5 抗氧化活性測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除率測定 DPPH自由基清除率測定參考Wu[11]的方法，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5.2 還原力測定 還原力測定采用鐵氰化鉀法，參考Oyaizu[12]的方法，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5.3 羥基自由基清除率測定 羥基自由基清除率測定采用鄰二氮菲比色法[13]，重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 復(fù)合酶添加量對多糖得率的影響 固定pH5.0，酶解溫度50℃，提取時間2h，考察不同復(fù)合酶添加量對多糖得率的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，多糖得率隨酶添加量增加而遞增，復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.8%后，提取增加率趨于平緩，這是因?yàn)榻狍w系中復(fù)合酶已接近飽和狀態(tài)，致使多糖得率增長平緩?？紤]酶的成本，宜將復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定為0.8%左右。

圖1 復(fù)合酶添加量對多糖得率的影響Fig.1 Effect of complex enzyme amount on the yield of polysaccharides

2.1.2 pH對多糖得率的影響 固定復(fù)合酶添加量0.8%，酶解溫度50℃，提取時間2h，考察不同pH對多糖得率的影響，結(jié)果見圖2。多糖得率隨著pH的升高，先急劇增加后減少，這表明復(fù)合酶催化水解斑玉蕈細(xì)胞壁較適宜的pH范圍為5.0～6.0，低于或高于適宜pH時，酶的活性降低，從而導(dǎo)致多糖得率降低。在pH5.5附近時，多糖得率相對較高，故選擇較優(yōu)pH為5.5。

圖2 pH對多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis pH value on the yield of polysaccharides

圖3 酶解溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on the yield of polysaccharides

2.1.3 酶解溫度對多糖得率的影響 固定復(fù)合酶添加量0.8%，pH5.0，提取時間2h，考察不同酶解溫度對多糖得率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，多糖得率在40～55℃呈顯著增加的趨勢，這是因?yàn)闇囟仍礁撸狍w系溶液的粘度越低，有助于胞內(nèi)多糖分子向外擴(kuò)散。但溫度大于55℃后，酶活受到抑制，多糖得率急劇下降，故選擇55℃為酶解溫度較優(yōu)值。

2.1.4 提取時間對多糖得率的影響 固定復(fù)合酶添加量0.8%，pH5.0，酶解溫度50℃，考察不同提取時間對多糖得率的影響，結(jié)果見圖4。多糖得率隨提取時間的延長逐漸增大，提取時間在1.0～2.5h之間，多糖得率顯著增加，當(dāng)時間超過2.5h后，提取增加率趨于平緩，表明大部分斑玉蕈多糖都已浸出，考慮到能耗，故選較優(yōu)提取時間為2.5h。

圖4 提取時間對多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides

2.2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表2所示。

2.2.1 回歸模型的建立與檢驗(yàn) 對表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用多元回歸擬合后，得到多糖得率（Y）與復(fù)合酶添加量（x1）、酶解pH（x2）、酶解溫度（x3）和提取時間（x4）的回歸方程：

對該回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

該模型達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），決定系數(shù)R2為0.9566，校正決定系數(shù)R2Adj為0.9132，信噪比RSN為14.92，可知該回歸方程擬合度和可信度均很高，故可用于設(shè)計(jì)范圍內(nèi)的預(yù)測。各因素對斑玉蕈多糖得率的影響大小為：復(fù)合酶添加量＞提取時間＞酶解pH＞酶解溫度。

對表3回歸模型系數(shù)的顯著性分析可見，一次項(xiàng)中，x1、x4極顯著（p＜0.01），x2、x3達(dá)到顯著水平（p＜0.05）；平方項(xiàng)的回歸系數(shù)均極顯著，說明各因素與多糖得率之間存在明顯的二次關(guān)系；二次項(xiàng)中僅有x1x4的回歸系數(shù)均達(dá)到顯著水平，表明復(fù)合酶添加量與提取時間之間的交互作用對斑玉蕈多糖的得率有顯著影響。如將不顯著項(xiàng)全部剔除，會導(dǎo)致回歸模型發(fā)生改變[14]，故保留p＜0.25的各項(xiàng)，簡化后的回歸方程為式（2）：

2.2.2 兩因素間的交互效應(yīng)分析 由表3可知，僅復(fù)合酶添加量與提取時間的交互作用對斑玉蕈多糖的得率有顯著影響，固定酶解溫度和pH于零水平，繪出符合酶添加量與提取時間的交互效應(yīng)的響應(yīng)面，如圖5所示。多糖得率隨復(fù)合酶添加量和提取時間的變化會產(chǎn)生較大變化。當(dāng)復(fù)合酶添加量處于較低水平（＜0.8%）時，多糖得率隨著提取時間的延長先明顯增加后又呈現(xiàn)出下降趨勢；當(dāng)復(fù)合酶添加量處于較高水平（＞0.8%）時，多糖得率隨著提取時間的延長逐漸提高，而當(dāng)提取時間超過2.8h后，多糖得率趨于緩慢下降。若要獲得較高的多糖得率，復(fù)合酶添加量應(yīng)該在0.8%～1.0%之間，提取時間應(yīng)該在2.5～3.0h之間。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance with regression model

圖5 復(fù)合酶添加量與提取時間的交互效應(yīng)對多糖得率的影響Fig.5 Interactive effect of complex enzyme amount and extraction time on the yield of polysaccharides

2.2.3 最佳條件優(yōu)化及驗(yàn)證結(jié)果 通過所得回歸模型對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件為：復(fù)合酶添加量0.9%、酶解pH5.4、酶解溫度55.6℃、提取時間2.8h，在此條件下多糖得率的最大理論值為4.68%。對此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)3次，實(shí)測平均得率為4.70%；對該工藝進(jìn)一步放大，取200g斑玉蕈干粉提取多糖，實(shí)測得率為4.72%，與預(yù)測值基本一致，表明該回歸模型具有較好的預(yù)測性能，可用于指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。

2.3 斑玉蕈多糖的抗氧化活性

圖6 斑玉蕈多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effects of polysaccharides from Hypsizigus marmoreus against DPPH radicals

2.3.1 清除DPPH自由基的能力 DPPH法是評價抗氧化活性的常用方法，抗氧化物質(zhì)可直接作用于DPPH自由基，使其顏色變淺，根據(jù)吸光度的變化可測定物質(zhì)的抗氧化活性。由圖6可知，在測定的質(zhì)量濃度范圍，斑玉蕈多糖對DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增大而增大，且呈良好的線性正相關(guān)，線性方程為：y=4.2263+0.5831x，R2=0.9823。以半數(shù)效應(yīng)濃度（IC50值），即清除率為50%時的樣品質(zhì)量濃度，作為評價抗氧化能力的指標(biāo)，由線性方程得斑玉蕈多糖清除DPPH自由基的IC50值為78.5μg/mL。

2.3.2 還原力 抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性與其還原力存在著直接的聯(lián)系，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。鐵氰化鉀法測定原理為：亞鐵氰化鉀被樣品還原為鐵氰化鉀，鐵氰化鉀與Fe3+形成普魯士藍(lán)，在700nm處有最大吸收峰，吸光度越大，則樣品的還原力越強(qiáng)。在50～250μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，斑玉蕈多糖的還原力隨著濃度的增加而增加，當(dāng)濃度為250μg/mL時，吸光度最大為0.382±0.01。

圖7 斑玉蕈多糖的還原力Fig.7 Reducing power of polysaccharides from Hypsizigus marmoreus

2.3.3 清除羥基自由基的能力 羥基自由基是已知活性最強(qiáng)的活性氧自由基，可奪取蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的氧原子，引起機(jī)體損傷，清除羥基自由基可能是生物體抵御疾病的最有效方式之一。斑玉蕈多糖對羥基自由基的清除作用如圖8所示，在50～250μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，斑玉蕈多糖對羥基自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增大而增大，且呈線性正相關(guān)，線性方程為：y=-8.4173+0.3427x，R2=0.9802，IC50值為170.5μg/mL。

圖8 斑玉蕈多糖對羥基自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effects of polysaccharides from Hypsizigus marmoreus against hydroxyl radicals

3 結(jié)論

本研究建立了酶輔助提取斑玉蕈多糖的最佳工藝條件，即復(fù)合酶（木瓜蛋白酶和纖維素酶按1∶1質(zhì)量比例配合）添加量0.9%、酶解pH5.4、酶解溫度55.6℃、提取時間2.8h，在此條件下多糖得率的最大理論值為4.68%。對此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)3次，實(shí)測平均得率為4.70%，從實(shí)測多糖得率看，酶輔助提取優(yōu)于傳統(tǒng)的熱水浸提法，比熱水浸提得率3.38%（由本實(shí)驗(yàn)室測得）高1.32%。

斑玉蕈多糖具有較好的抗氧化活性，在一定范圍內(nèi)，其抗氧化能力與多糖質(zhì)量濃度呈線性正相關(guān)，清除DPPH和羥基自由基的IC50值分別為78.5μg/mL和170.5μg/mL。

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