寧 旭，楊德猛，王長庚，李江偉，葉 川，任世超

(1 貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴陽 550004;2 江西省萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院)

結(jié)核桿菌(MTB)是對人類健康威脅最大的病原體之一。骨關(guān)節(jié)結(jié)核是由MTB通過血液或淋巴系統(tǒng)播散至骨與關(guān)節(jié)，造成血供豐富和負(fù)重大或活動(dòng)較多的骨關(guān)節(jié)發(fā)生壞死，是發(fā)病率最高的肺外結(jié)核疾病，占肺外結(jié)核總發(fā)病率的35%［1］。研究表明，TNF-α能通過與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，直接或間接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化、激活和凋亡［2-4］。但在骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)病過程中TNF-α是否調(diào)控破骨細(xì)胞分化、激活，導(dǎo)致骨破壞鮮見報(bào)道。2011年7月～2012年9月，我們進(jìn)行了相關(guān)研究。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 3周齡雄性昆明小鼠6只，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;標(biāo)準(zhǔn)MTB(mycobacterium tuberculosis H37rv)由貴陽醫(yī)學(xué)院微生物教研室提供。主要實(shí)驗(yàn)材料有α-MEM培養(yǎng)基(Gibico)，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒(Sigma)，胎牛血清(南美Hyclone)，小鼠TNF-α試劑盒(ADL)。

1.2 方法

1.2.1 MTB凍干物的制備 取對數(shù)期MTB，加入無菌水，制成混懸液。超聲裂解組取MTB混懸液，冰浴條件下超聲裂解儀裂解，設(shè)置電壓300 W，超聲時(shí)間8 s，超聲間隔10 s，裂解30 min，所得混懸液低溫離心50 min，取上清液，0.45 μm 濾過膜過濾、分裝、凍干，4℃保存?zhèn)溆?。熱處理組取MTB混懸液，80℃密封水浴30 min×2次，所得混懸液分裝、凍干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小牛骨磨片的制備 取新鮮小牛四肢皮質(zhì)骨，手工修成0.5 cm×0.5 cm 大小骨塊并打磨光滑，在5%戊二醛固定2 h后，用Leica硬組織切片機(jī)將骨塊切成10 μm厚骨片，依次行梯度乙醇脫水、0.25 mol/L稀氨水超聲清洗儀清洗3次，自然干燥后用鉛筆標(biāo)記正反面，經(jīng)γ射線照射消毒后，浸泡在含鏈霉素和青霉素各1000 U/mL的PBS液中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 小鼠破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)與分組 將6只小鼠用脫髓法處死，75%乙醇浸泡5 min，無菌操作下快速分離肱骨及股骨，剪去兩端骨骺，用α-MEM培養(yǎng)液(含1000 U/mL鏈霉素、1000 U/mL青霉素、15%胎牛血清)反復(fù)沖洗骨髓腔至顏色發(fā)白。收集骨髓細(xì)胞沖洗液，吹打混勻，過濾，離心棄上清;用α-MEM培養(yǎng)液重懸2次后接種于培養(yǎng)皿中，在5%CO2、37℃孵箱培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)液，離心，重懸，計(jì)數(shù)，鏡下調(diào)節(jié)單核細(xì)胞密度至2.0×106/mL。接種0.5 mL細(xì)胞懸液于24孔培養(yǎng)板中(12個(gè)含骨磨片)。設(shè)熱處理組和超聲裂解組各5個(gè)副孔，其中1個(gè)空白對照，其他4孔分別加入熱處理MTB凍干物和超聲裂解MTB凍干物，調(diào)整MTB濃度至0.2、2、20、200 μg/mL，置入 5%CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)，每48 h更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次，始終維持各組MTB凍干物濃度不變，誘導(dǎo)7 d。

1.2.4 TNF-α 定量檢測 收集誘導(dǎo) 24、48 h后的細(xì)胞培養(yǎng)液，采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的TNF-α濃度。首先于酶標(biāo)儀中測定ELISA試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品在450 nm波長處的吸光度(OD)值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的OD計(jì)算對應(yīng)濃度值。

1.2.5 TRAP染色及骨陷窩的觀察、計(jì)數(shù) 細(xì)胞誘導(dǎo)7 d，傾去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用去離子水沖洗細(xì)胞3次，依照TRAP染色試劑盒說明書配置固定液及染色液，并將染色液水浴至37℃。固定液固定細(xì)胞30 s，棄固定液，沖洗3遍。每孔加入150 μL染色液，用錫箔紙包裹培養(yǎng)板后，置于37℃孵育箱中反應(yīng)60 min，去離子水沖洗晾干。將骨磨片放入0.25 mol/L氨水中超聲洗滌5 min×3次，去除附著細(xì)胞，用1%甲苯胺藍(lán)溶液室溫染色3～4 min，1%鹽酸乙醇分化，丙酮脫水，蒸餾水清洗，室溫晾干。鏡下觀察每孔中TRAP陽性細(xì)胞(陽性細(xì)胞核≥3個(gè))計(jì)數(shù)及骨陷窩情況。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果用表示，組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熱處理組和超聲裂解組TNF-α濃度比較 誘導(dǎo)24 h后，熱處理組中各濃度組與空白對照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均 ＞0.05);超聲裂解組中除0.2 μg/mL組TNF-α濃度與空白對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)外，其余各濃度組均高于空白對照組(P均 ＜0.05)，且隨 MTB 濃度增加，TNF-α 濃度逐漸增加，不同濃度組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＜0.05)。誘導(dǎo) 48 h 后，超聲裂解組中除 0.2 μg/mL組TNF-α濃度與空白對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)外，其余各濃度組均高于空白對照組(P均＜0.05)，且隨 MTB濃度增加，TNF-α 濃度也逐漸增加，不同濃度組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均 ＜0.05)。見表1。

2.2 熱處理組和超聲裂解組TRAP陽性細(xì)胞比較誘導(dǎo)7 d后，熱處理組中的實(shí)驗(yàn)組和空白對照組均有少量TRAP陽性細(xì)胞形成，各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＞0.05)。超聲裂解組中各實(shí)驗(yàn)組均有TRAP陽性細(xì)胞形成，除0.2 μg/mL組與空白對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)外，2、20 μg/mL組與空白對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＜0.05)，200 μg/mL 組在誘導(dǎo)培養(yǎng) 3 d 后，培養(yǎng)液中出現(xiàn)大量漂浮死亡細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)模糊、裂解。

表1 熱處理組和超聲裂解組誘導(dǎo)24、48 h后培養(yǎng)液中的TNF-α濃度比較(pg/mL，)

表1 熱處理組和超聲裂解組誘導(dǎo)24、48 h后培養(yǎng)液中的TNF-α濃度比較(pg/mL，)

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05;超聲裂解組0.2、2、20、200 μg/mL 組間比較，P ＜0.05

組別 n 誘導(dǎo)24 h的TNF-α濃度 誘導(dǎo)48 h的TNF-α濃度5.160.2 μg/mL 組 30 77.72 ±3.67 94.06 ±6.54 92.24 ±7.68 104.06 ± 6.862 μg/mL 組 30 79.20 ±5.20 122.95 ±5.67* 96.45 ±9.79 314.95 ±10.82*20 μg/mL 組 30 77.40 ±5.03 150.54 ±6.62* 93.07 ±9.78 570.06 ±17.08*200 μg/mL 組 30 79.76 ±4.06 224.75 ±9.06* 96.54 ±9.67 633.64 ±20.17熱處理組 超聲裂解組空白對照組 30 76.78 ±4.56 92.91 ±4.25 95.81 ±5.84 102.62 ±熱處理組 超聲裂解組*

2.3 熱處理組和超聲裂解組骨吸收陷窩計(jì)數(shù)比較誘導(dǎo)7 d后，各組骨片均出現(xiàn)圓形、橢圓形或臘腸形的連續(xù)或不連續(xù)骨陷窩，熱處理組各濃度組與空白組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＞0.05)。超聲裂解組中除0.2 μg/mL組與空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)外，其余各濃度組與空白組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＜0.05)，且隨濃度增加，骨陷窩計(jì)數(shù)逐漸增大，但200 μg/mL組與20 μg/mL組比較明顯減少。見表2。

表2 熱處理組和超聲裂解組破骨細(xì)胞、骨陷窩計(jì)數(shù)比較(個(gè)，)

表2 熱處理組和超聲裂解組破骨細(xì)胞、骨陷窩計(jì)數(shù)比較(個(gè)，)

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05;超聲裂解組0、2、20、200 μg/mL 組間比較，P ＜0.05

組別 n 破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)骨陷窩計(jì)數(shù)30 3.67 ±1.37 3.51 ±2.24 4.50 ±2.26 5.27 ±2.160.2 μg/mL 組 30 3.83 ±2.64 8.17 ±2.79 5.83 ±1.47 7.17 ±1.172 μg/mL 組 30 4.33 ±2.50 17.00 ±4.89* 5.50 ±1.05 13.17 ±2.22*20 μg/mL 組 30 4.17 ±2.78 28.67 ±5.89* 5.67 ±1.86 28.33 ±4.22*200 μg/mL 組 30 4.67 ±1.97 0* 5.83 ±1.72 3.83 ±1.83熱處理組 超聲裂解組空白對照組熱處理組 超聲裂解組*

3 討論

骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者骨質(zhì)破壞的具體機(jī)制尚不明確。破骨細(xì)胞的成熟和活化主要依賴于成骨細(xì)胞表達(dá)核因子κB受體激活劑配體與破骨前體細(xì)胞表面核因子κB受體的結(jié)合，通過經(jīng)典信號通路或旁路，導(dǎo)致破骨細(xì)胞成熟和活化［5］。當(dāng)破骨細(xì)胞骨吸收活動(dòng)與成骨細(xì)胞骨形成活動(dòng)的動(dòng)態(tài)平衡紊亂時(shí)，易導(dǎo)致骨吸收發(fā)生［6］。TNF-α在控制MTB感染過程中起重要作用。Al-Attiyah等［7］將肺結(jié)核患者的外周血單核細(xì)胞與MTB相關(guān)抗原體外共同培養(yǎng)2 d后，與空白組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液中的TNF-α濃度明顯增高。本研究中，熱處理組與空白對照組相比，破骨細(xì)胞數(shù)目、培養(yǎng)液中的TNF-α濃度、骨陷窩計(jì)數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明熱處理MTB凍干物不能刺激骨髓單核細(xì)胞分泌TNF-α和誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成;超聲裂解組與空白對照組比較，破骨細(xì)胞數(shù)目、培養(yǎng)液中的TNF-α濃度、骨陷窩計(jì)數(shù)均高于對照組(0.2 μg/mL組除外)，表明超聲裂解MTB凍干物能刺激骨髓單核細(xì)胞分泌TNF-α和誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成，并導(dǎo)致骨質(zhì)破壞。

超聲裂解組中，隨著MTB濃度和培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞培養(yǎng)液中的TNF-α濃度逐漸增高，破骨細(xì)胞數(shù)量和骨陷窩計(jì)數(shù)逐漸增加。表明超聲裂解MTB凍干物能刺激骨髓單核細(xì)胞分泌TNF-α與受體結(jié)合，直接或間接激活 NF-κB、JNK、p38、ERK 等信號通路而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成、激活，從而調(diào)控破骨細(xì)胞形成及活化，導(dǎo)致骨質(zhì)破壞。當(dāng)超聲裂解MTB凍干物達(dá)到200 μg/mL時(shí)，誘導(dǎo)3 d后培養(yǎng)液出現(xiàn)大量漂浮死亡細(xì)胞，骨陷窩數(shù)明顯降低。其原因可能為培養(yǎng)液中TNF-α濃度過高致骨髓單核細(xì)胞及誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞死亡［8］，也可能與高濃度超聲裂解MTB凍干物直接或間接導(dǎo)致細(xì)胞死亡有關(guān)。

MTB感染人體后，通過激活MAKP信號傳導(dǎo)通路促進(jìn)單核細(xì)胞趨化因子、TNF-α合成及釋放，從而調(diào)控巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞對炎癥的反應(yīng)，抑制細(xì)菌生長和誘導(dǎo)肉芽腫形成［9］。結(jié)核病是一種慢性疾病，MTB在肉芽腫和吞噬細(xì)胞中持續(xù)存在，MTB或其胞內(nèi)蛋白很可能導(dǎo)致TNF-α高于正常水平;而TNF-α又能通過細(xì)胞間信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成及活化，從而導(dǎo)致骨質(zhì)破壞。這可能是MTB感染人體引起骨關(guān)節(jié)壞死的原因之一。

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