楊子江，陳格飛，孟清

東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620

蜘蛛絲 (Spider silk) 是一種天然蛋白質(zhì)纖維，材料學(xué)特性卓越[1-2]，作為一種生物大分子多聚物，易于生物降解且具有良好的生物兼容性，被越來(lái)越多地用于藥載運(yùn)輸和細(xì)胞組織工程等多方領(lǐng)域[3-6]。蜘蛛可分泌 6種蛛絲纖維，其中次壺腹腺絲 (又稱臨時(shí)捕獲絲) 主要用于加固蛛網(wǎng)和捕獵等，具有和牽引絲相似的優(yōu)良材料學(xué)性能，但不同的是，在水環(huán)境中臨時(shí)捕獲絲不發(fā)生超收縮現(xiàn)象，這一特點(diǎn)使其具有特殊的應(yīng)用價(jià)值[6-9]。

現(xiàn)今，蛛絲蛋白的研究多以牽引絲 (Major ampullate silk) 和鞭毛狀絲 (Flagelliform) 為主，主要通過(guò)其特征模塊的改造和拼接，表達(dá)出串聯(lián)的重組蛛絲蛋白，進(jìn)行相關(guān)方面的研究[10-13]。而這些重組蛛絲遠(yuǎn)遠(yuǎn)缺失了天然蛛絲的性質(zhì)及研究?jī)r(jià)值，如何實(shí)現(xiàn)仿生蛛絲的表達(dá)是當(dāng)今首要解決的問(wèn)題。自 1997起科學(xué)家就開始嘗試采用各類系統(tǒng)表達(dá)蛛絲蛋白，包括大腸桿菌、酵母、昆蟲、煙草、老鼠以及山羊等[2,14]。由于蛛絲蛋白序列重復(fù)度高且甘氨酸 (Glycine) 和丙氨酸(Alanine) 含量大 (高于60%)，導(dǎo)致表達(dá)中容易出現(xiàn)特殊的 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄不完全和翻譯提前終止等現(xiàn)象，因而常出現(xiàn)表達(dá)量低、產(chǎn)物可溶性差、大小不均一等結(jié)果，到目前為止，尚沒(méi)有一個(gè)合適的表達(dá)系統(tǒng)可用于蛛絲蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)。

近期，世界上首次報(bào)道了大腹園蛛Araneus ventricosus臨時(shí)捕獲絲蛋白 (Minor ampullate spidroin，MiSp) 全長(zhǎng)編碼基因序列，該蛋白序列富含Gly和 Ala (約為64%)，且主要由GX、GXX、GXXX和poly-A等重復(fù)模塊組成[15]。為A. ventricosusMiSp全序列以及其他絲蛋白基因的表達(dá)，尋求合適的表達(dá)系統(tǒng)，本研究以大腸桿菌BL21(DE3) 的表達(dá)為參照，在畢赤酵母GS115中首次嘗試了MiSp重復(fù)編碼區(qū)的部分序列的表達(dá)。該序列長(zhǎng)1 348 bp，我們將它分別導(dǎo)入GS115和 BL21(DE3) 表達(dá)載體 pPic3.5和 PKT，并在GS115及 BL21(DE3) 中誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA純化后由SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)，結(jié)果表明兩種系統(tǒng)都可成功表達(dá)該段序列，且可溶性好。相比而言，優(yōu)化后的畢赤酵母GS115系統(tǒng)的表達(dá)水平 (產(chǎn)量/產(chǎn)率：相對(duì)表達(dá)量) 明顯高于大腸桿菌BL21(DE3)，就自身未優(yōu)化前也有很大提高 (約6～7倍)。表達(dá)產(chǎn)物相對(duì)完整穩(wěn)定，純化回收效率也遠(yuǎn)高于大腸桿菌系統(tǒng)。由此，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)相比大腸桿菌系統(tǒng)更適合蛛絲蛋白重復(fù)片段的表達(dá)，是一種更好的天然蛛絲蛋白表達(dá)宿主。本研究為選擇天然蛛絲蛋白基因表達(dá)系統(tǒng)提供了線索，也為A. ventricosusMiSp全序列的表達(dá)奠定了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

MiSp陽(yáng)性克隆由早期建立的A. ventricosusfosmid文庫(kù)篩選鑒定得到。實(shí)驗(yàn)所用酵母表達(dá)載體pPic3.5購(gòu)自Invitrogen公司，大腸桿菌表達(dá)載體PKT則由PET32a (+) 改造而來(lái)。實(shí)驗(yàn)所用的宿主菌E. coliBL21 (DE3)、DH5α和P. pastorisGS115分別購(gòu)置Merck公司、上海生物工程技術(shù)有限公司和Invitrogen公司。DNA限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購(gòu)自Fermentas公司。Phusion mix購(gòu)自 NEB公司。質(zhì)粒抽提和膠回收試劑盒購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司。酵母基因組抽提試劑盒購(gòu)自天根公司。蛋白純化Ni-NTA購(gòu)自Qiagen公司。6×His-tag, anti-mouse，mAb抗體購(gòu)自 Merck公司。Western blotting試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。實(shí)驗(yàn)中所用培養(yǎng)基配方參見分子克隆第3版[24]。

1.2 酵母表達(dá)載體PIC3.5-P1的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆GS115: PIC3.5-P1的鑒定

以A. ventricosusfosmid文庫(kù)篩選鑒定的MiSp陽(yáng)性克隆為模板，設(shè)計(jì) PCR引物 (P1和P2，見表1)，并分別在引物上下游引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和EcoRⅠ。PCR擴(kuò)增目的片段P1經(jīng)酶切后與pPic3.5載體連接，命名為PIC3.5-P1，該重組質(zhì)粒分別經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定。P1編碼序列如圖1所示。

參照Invitrogen公司的酵母表達(dá)手冊(cè)，將由StuⅠ單切線性化的 PIC3.5-P1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入GS115感受態(tài)細(xì)胞，涂布于 MD平板，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，采用天根生物科技有限公司酵母基因組提取試劑盒抽提酵母GS115: PIC3.5-P1重組基因組，并以其上特定序列為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，引物P3和P4 (見表 1)。

1.3 PIC3.5-P1在酵母中的表達(dá)優(yōu)化和鑒定

挑取陽(yáng)性重組子單克隆至50 mL BMGY培養(yǎng)液中，30 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)。每3 h取樣測(cè)培養(yǎng)液吸光度 (OD600)，并繪制生長(zhǎng)曲線圖。

圖1 P1編碼的氨基酸序列 (與intein-his融合表達(dá))Fig. 1 Protein sequence deduced from P1 (fused with intein and his). The letter in bold: amino acid sequence of intein.There are 8 phosphorylation sites showed in 3333: SSAD, SANE, VGTGTGSSAGYGRGAGAGAGAGAAAGSGAG AALK, KGREVLSY, LSYNE, SIK, TVR, TRAE; and the third is most like to happen. There are 2 glycosylation sites showed in ( ): NETL, NSTV.

將重組GS115接種于50 mL BMGY中，同時(shí)引入對(duì)照 (空酵母菌GS115和帶有pPic3.5空載體的GS115菌株)，30 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng)至OD600達(dá) 2～6，約 18～20 h。方案 1 (常規(guī)組)：直接取 BMGY培養(yǎng)液，離心收集菌體，適量轉(zhuǎn)接至BMMY培養(yǎng)基，至OD600達(dá)0.8～1.0，每24 h補(bǔ)加甲醇使其濃度保持0.5%，誘導(dǎo)48 h。方案2(優(yōu)化組)：取1～2 mL培養(yǎng)液至新鮮50 mL BMGY培養(yǎng)基至OD600達(dá) 0.1～0.2，250 r/min搖床培養(yǎng)至OD600達(dá)0.8～1.0，離心收集菌體，將全部菌體轉(zhuǎn)移至50 mL BMMY培養(yǎng)基，OD600達(dá)0.8～1.0，30 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)，每24 h補(bǔ)加甲醇使其濃度保持0.5%，誘導(dǎo)48 h。

吸取誘導(dǎo)后的菌液至 50 mL離心管中，3 000×g離心5 min，棄上清，收集菌體，按10%(W/V) 加入裂解液 (50 mmol/L Tris，50 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl，pH 7.4) 重懸細(xì)胞。取20 μL細(xì)胞懸浮液，加入5 μL 5×上樣緩沖液，100 ℃水浴10 min，順勢(shì)離心后進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting鑒定。

表1 PCR引物序列Table 1 primer sequence

1.4 酵母表達(dá)產(chǎn)物PIC3.5-P1的純化

誘導(dǎo)后的菌液轉(zhuǎn)移至 50 mL離心管中，3 000×g離心5 min收集菌體，按10% (W/V) 加入裂解液 (50 mmol/L Tris，50 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl，pH 7.4) 重懸細(xì)胞。采用JnBio的高壓破碎儀1 500～1 800 Pa破碎酵母，反復(fù)3次，8 000×g離心20 min分離上清和沉淀?？扇苄缘鞍缀筒豢扇苄缘鞍追謩e采用非變性和變性純化的方法純化，方法均參照Qiagen標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)。

1.5 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建、表達(dá)及純化

借助于 PIC3.5-P1兩端的酶切位點(diǎn)BamHⅠ和EcoRⅠ，酶切后經(jīng)連接反應(yīng)插入到 PKT載體，構(gòu)建克隆 PKT-P1，經(jīng)菌液 PCR、酶切和測(cè)序鑒定。

選取重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)，挑取單克隆37 ℃培養(yǎng)10 h, 按1∶100的比例接種于50 mL LB培養(yǎng)基 (卡那霉素 30 μg /mL)，培養(yǎng)至OD600值達(dá) 0.6～1.0時(shí)加入終濃度為 0.8 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)2.5 h，蛋白鑒定同1.3。裂解液重懸離心收集的菌體，超聲波破碎細(xì)胞，8 000×g低溫離心20 min分離上清和沉淀。純化方法同1.4。

2 結(jié)果

2.1 GS115:PIC3.5-P1及對(duì)照 BL21(DE3):PKT-P1陽(yáng)性克隆的鑒定

通過(guò)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切反應(yīng)，將目標(biāo)DNA片段分別插入載體pPic3.5和PKT，構(gòu)建克隆PIC3.5-P1和PKT-P1。重組質(zhì)粒由BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠圖譜檢測(cè)正確。另外，測(cè)序結(jié)果證實(shí)，該片段為MiSp重復(fù)區(qū)片段，且無(wú)核苷酸突變，可用于后續(xù)的表達(dá)研究。

載體 PIC3.5-P1通過(guò)轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母 GS115后，涂布于his?營(yíng)養(yǎng)缺陷MD培養(yǎng)基，3～5 d后，可見生長(zhǎng)良好的菌落，經(jīng)過(guò)PCR鑒定證實(shí)P1基因通過(guò)同源重組轉(zhuǎn)入酵母基因組中。

BL21(DE3): PKT-P1轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌液PCR、測(cè)序鑒定，結(jié)果正確。

2.2 GS115:PIC3.5-P1表達(dá)優(yōu)化及與參照BL21(DE3): PKT-P1的比較

目標(biāo)基因長(zhǎng)為1 348 bp，融合表達(dá)產(chǎn)物的理論分子量為38.54 kDa。誘導(dǎo)菌液SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖 2所示，P1在 GS115出現(xiàn)和對(duì)照BL21(DE3) 大小一致的帶，為34～50 kDa，陰性對(duì)照相應(yīng)位置則無(wú)條帶。以組氨酸標(biāo)簽 (6×his)作為檢測(cè)抗原，以6×His-tag、Anti-Mouse、mAb為一抗，Alk-Phos. conjugated Anti-Mouse為二抗，參照Invitrogen產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)技術(shù)，采用Western blotting進(jìn)一步檢測(cè)，該條帶為目標(biāo)蛋白。此外圖中于50～90 kDa間，大約80 kDa處也出現(xiàn)了條帶，而這初步推測(cè)是由于酵母的超糖基化、磷酸化所致，且本序列經(jīng)相關(guān)生物學(xué)軟件分析，如圖1所示，存在多處糖基化、磷酸化位點(diǎn)，而這種超糖基化或磷酸化現(xiàn)象與優(yōu)化條件是緊密相關(guān)的。

2.3 PIC3.5/PKT-P1表達(dá)產(chǎn)物的純化

在變性 (含有8 mol/L 尿素) 與非變性的條件下通過(guò)Ni-NTA對(duì)GS115：PIC3.5-P1菌體破碎產(chǎn)物沉淀及上清進(jìn)行純化。如圖3所示，在e1-3泳道中34～50 kDa處可以看到明顯的目的條帶，而沉淀中無(wú)明顯的目的蛋白條帶 (E1-E6)，這表明目標(biāo)產(chǎn)物，即MiSp部分重復(fù)區(qū)，能以可溶形式存在破碎液上清中。對(duì)于參照大腸桿菌，采用相同的辦法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化處理發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)蛋白也是以可溶的形式存在。除了目的條帶，26～34 kDa處還發(fā)現(xiàn)一條帶，這是部分目標(biāo)蛋白中 P1融合的 intein蛋白在純化過(guò)程中斷裂后剩余的部分P1，與理論大小26.61 kDa相符，研究表明intein融合蛋白表達(dá)時(shí)容易發(fā)生斷裂現(xiàn)象[16]。本實(shí)驗(yàn)最初融合intein大約12.45 kDa，是為后續(xù)剪接實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備，與蛛絲基因表達(dá)無(wú)關(guān)，這里不進(jìn)一步討論。

圖2 P1在BL21(DE3)和GS115中表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)Fig. 2 SDS-PAGE and Western blotting analysis of the recombinant proteins derived from P1 in BL21 (DE3) and GS115 respectively. M: protein marker. (A) SDS-PAGE of BL21 (DE3) culture. 1: 37 °C induced 2.5 h; 2: negative control, strain without transform. (B) SDS-PAGE of GS115 after 48 h induction. 1: negative control; 2: negative control,strain with empty plasmid; 3: optimized expression sample; 4: not optimized expression sample. (C) Western blotting of BL21 (DE3). 1: 37 °C induced 2.5 h; 2: negative control, strain without transform; 3: 25 °C induced 12 h. (D) Western blotting of GS115 after 48 h induction. 1: optimized expression sample; 2–3: not optimized expression sample; 4:negative control, strain without transform.

純化結(jié)果進(jìn)一步與參照比較發(fā)現(xiàn)，純化后GS115的產(chǎn)率 (目的蛋白占總蛋白的比例) 明顯高于BL21(DE3)，如表 3所示，可達(dá)到 13～14倍。

圖3 P1在 BL21 (DE3) 和GS115表達(dá)產(chǎn)物在非變性與變性條件下純化的檢測(cè)Fig. 3 SDS-PAGE for purification of P1 expression products of BL21 (DE3) and GS115 in natured and denatured with 8 mol/L Urea condition. M: protein marker; e1?e3: native purification of supermatant; E1?E6: 8 mol/L Urea denature purification of precipitate. (A) SDS-PAGE for purification of P1 expression products of GS115. (B) SDS-PAGE for purification of P1 expression products of BL21 (DE3).

2.4 P1表達(dá)的優(yōu)化及產(chǎn)量、產(chǎn)率及純化效率的分析

對(duì)P. pastoris表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了初步優(yōu)化，首先統(tǒng)計(jì)繪制了重組菌在 BMGY培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，如圖4所示。

為同時(shí)保證誘導(dǎo)時(shí)適度的菌體密度和最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，選取 18～20 h對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的BMGY培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于新鮮的BMGY培養(yǎng)基。在新鮮的 BMGY培養(yǎng)基中菌體重新分裂至OD600大約0.8左右，離心后按1∶1轉(zhuǎn)接至新鮮BMMY培養(yǎng)基。如此通過(guò)再次分裂，保證新生的菌株在狀態(tài)最佳時(shí)誘導(dǎo)；同時(shí)，誘導(dǎo)時(shí)菌體密度較低，保證了充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。參照SDS-PAGE表達(dá)圖譜，利用Image J軟件比較分析各組蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如表2所示，優(yōu)化后的表達(dá)量可提高6～7倍。

圖4 重組菌株GS115: PIC3.5-P1在BMGY的生長(zhǎng)曲線Fig. 4 growth curve of recombinant GS115: PIC3.5-P1 in BMGY.

如表 3所示，我們分析比較了純化前后P. pastoris和E. coli中目的蛋白的產(chǎn)量和產(chǎn)率，并進(jìn)一步計(jì)算了相應(yīng)的純化效率。P. pastoris和E. coli中重組蛋白的產(chǎn)量和產(chǎn)率存在較大差別，根據(jù)Image J分析比較的數(shù)據(jù)，純化前P. pastoris表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)初步優(yōu)化后，表達(dá)量可提高為原來(lái)的6～7倍，達(dá)到E. coli的 2～3倍，產(chǎn)率達(dá)E. coli的6倍，由此可以看出，兩種表達(dá)系統(tǒng)對(duì)P1的表達(dá)水平存在較大的差別。另外經(jīng)純化，表達(dá)差距進(jìn)一步擴(kuò)大，說(shuō)明P. pastoris和E. coli兩種表達(dá)系統(tǒng)的純化效率也存在較大差異，如表3和表4所示，P. pastoris為E. coli的6倍左右。

表2 純化前目的蛋白P1的產(chǎn)量、產(chǎn)率 (目的蛋白在表達(dá)總蛋白中的含量) 在BL21(DE3)和GS115中常規(guī)組及優(yōu)化組中的比較Table 2 Comparison of optimization and no optimization for protein yields and protein productivity in two expression system before purification

表3 目的蛋白P1在BL21(DE3)和GS115的產(chǎn)量在純化前后的比較Table 3 Comparison of purify efficiency in the two expression system for protein yields

表4 目的蛋白P1在BL21(DE3)和GS115的產(chǎn)率在純化前后的比較Table 4 Comparison of purify efficiency in the two expression system for protein productivity

3 討論

自20世紀(jì)80年代以來(lái)，科學(xué)家就開展了蜘蛛絲的多項(xiàng)研究，包括基因克隆、蛋白表達(dá)以及仿生絲纖維的應(yīng)用等，但蛛絲在表達(dá)上的困難嚴(yán)重阻礙它的發(fā)展。迄今為止，國(guó)內(nèi)外只獲得了3種絲纖維蛋白的全長(zhǎng)基因組序列，分別為 MaSp(Major ampullate spidroin)、MiSp 和 AcSp(Aciniform spidroin)，其中MaSp和AcSp均來(lái)自黑寡婦蜘蛛Latrodectus hesperus，而MiSp則來(lái)自A. ventricosus，由本課題組篩選鑒定[15,20-21]。這些完整的蛛絲蛋白，分子量大、編碼基因 GC含量高，常見的表達(dá)系統(tǒng)很難完成其全長(zhǎng)的表達(dá)。而研究表明，高分子量是決定蛛絲性能的重要因素，對(duì)此科學(xué)家分別嘗試了不同的方法來(lái)獲取高分子量的重組蛛絲蛋白[11,13]。2010年韓國(guó)科學(xué)家在代謝水平對(duì)大腸桿菌進(jìn)行改造，補(bǔ)充Gly酰tRNA，最終表達(dá)出284 kDa的MaSp重組串聯(lián)蛋白，但表達(dá)量較低，獲得的重組蛛絲蛋白的纖維性能只有天然蛛絲的一半[13]。2012年德國(guó)科學(xué)家嘗試了用蛋白質(zhì)內(nèi)含子 (Intein) 介導(dǎo)拼接的方法表達(dá)出高分子量的蛛絲蛋白，他們利用intein的體外剪接反應(yīng)，在體外讓融合 intein的蛛絲蛋白相互剪接產(chǎn)生Flag蛋白的串聯(lián)體，產(chǎn)物可達(dá)到約300 kDa，但是該方法特異性較差，隨機(jī)性較強(qiáng)，產(chǎn)物的大小無(wú)法控制，因此難于得到目標(biāo)產(chǎn)物，不適合大規(guī)模的純化生產(chǎn)[11]。

為了尋找適合表達(dá)天然蛛絲蛋白全長(zhǎng)基因的系統(tǒng)，本研究在P. pastoris表達(dá)系統(tǒng)中首次嘗試表達(dá)天然的MiSp部分重復(fù)序列 (P1)，并與大腸桿菌表達(dá)結(jié)果進(jìn)行比較。P1編碼氨基酸序列富含Gly和Ala且高度重復(fù)，符合蛛絲蛋白序列的典型特征，在異源表達(dá)時(shí)，容易因?yàn)樗拗髅艽a子使用的偏愛性及稀有氨基酸合成代謝不足而受到影響；另外，片段本身的大小亦會(huì)一定程度上決定表達(dá)水平和產(chǎn)物的完整性，而有研究報(bào)道E. coli在表達(dá)高重復(fù)的大片段蛛絲蛋白時(shí)，容易出現(xiàn)表達(dá)提前終止現(xiàn)象，而片段達(dá)到1 000氨基酸長(zhǎng)度，表達(dá)效率就會(huì)明顯降低[2,13,22]。本研究結(jié)果表明在P. pastoris和E. coli系統(tǒng)中，P1均實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，蛋白產(chǎn)物可溶性好 (圖3)，采用非變形純化即可得到可溶性的蛋白。我們還分析比較了兩種表達(dá)系統(tǒng)中 P1表達(dá)量和產(chǎn)率，在優(yōu)化后P. pastoris表達(dá)系統(tǒng)中，P1表達(dá)量高，為E. coli表達(dá)系統(tǒng)的 2倍左右 (表 2)。這是由于天然的MiSp基因含有數(shù)十個(gè)精氨酸 (Arginine) 等，E. coli系統(tǒng)因?yàn)槊艽a子的偏愛性無(wú)法高效地表達(dá)該氨基酸；另外，由于P1編碼的氨基酸Gly和Ala含量非常高 (60%左右)，E. coli表達(dá)系統(tǒng)的氨基酸合成亦會(huì)受到影響。P. pastoris為真核表達(dá)系統(tǒng)，可以更好地編碼上述稀有密碼子。參照GS115生長(zhǎng)曲線 (圖4)，對(duì)P. pastoris表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行初步優(yōu)化，選擇18～20 h對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的BMGY培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接新鮮 BMGY，離心收集菌體去除了陳舊的培養(yǎng)基等，減輕了經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的代謝產(chǎn)生的有害物的影響以及pH變化的影響、提高菌體的代謝水平，菌體生長(zhǎng)狀態(tài)；二次培養(yǎng)達(dá)到較低菌種密度開始誘導(dǎo)，外環(huán)境營(yíng)養(yǎng)豐富，更好地促進(jìn)了外源基因的表達(dá)，優(yōu)化前后表達(dá)量可提高6～7倍。P. pastoris系統(tǒng)是常用的真核表達(dá)系統(tǒng)，較E. coli而言，有更大的優(yōu)化空間 (包括誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)甲醇濃度和擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)等)，且易于擴(kuò)大，適合工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)，是表達(dá)蛛絲蛋白或其他多重復(fù)大片段分子的良好宿主[23]。由于蛛絲基因本身的特點(diǎn)，為了獲取更高表達(dá)量的重組蛋白，我們將會(huì)進(jìn)一步優(yōu)化P. pastoris表達(dá)系統(tǒng)并嘗試MiSp天然基因和其他蛛絲蛋白基因的全長(zhǎng)表達(dá)。

本研究通過(guò)對(duì)P. pastoris和E.coli兩種表達(dá)系統(tǒng)地比較以及對(duì)P. pastoris系統(tǒng)地優(yōu)化，證明了P. pastoris作為天然蛛絲蛋白MiSp表達(dá)宿主的優(yōu)越性。為天然蛛絲蛋白基因可溶性表達(dá)提供了線索，也為A. ventricosusMiSp全序列的表達(dá)提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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