廣東恒興飼料實業(yè)股份有限公司科研技術(shù)中心 朱雙紅 韓垂旺

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種國家重點實驗室 鄧昌彥 鄭 嶸＊

豬生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)是按照一定比例，將功能微生物（或EM菌劑）與墊料（木屑、鋸末、米糠、谷殼等）等輔助材料及活化劑混合發(fā)酵，然后平鋪于圈舍內(nèi)，豬只飼養(yǎng)在發(fā)酵床上，其排泄的糞尿與墊料在豬只翻拱或人工翻耕下混合發(fā)酵，是一種集豬只飼養(yǎng)與糞尿處理同步進(jìn)行的環(huán)保養(yǎng)豬技術(shù) （陳玉紅等，2010；Tam和 Vrijmoed，1993）。

生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)的實質(zhì)是微生物的代謝和發(fā)酵作用。發(fā)酵床墊料中，除了土著微生物外，還人為添加了一些功能性微生物，它們在相互作用的過程中，群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量會發(fā)生很大變化，產(chǎn)生一些優(yōu)勢菌群。這些優(yōu)勢菌群在發(fā)酵床運行過程中可能發(fā)揮重要作用，因此，有必要對墊料中優(yōu)勢菌群的組成和作用進(jìn)行研究，以期開發(fā)出安全、穩(wěn)定、高效的微生物菌劑，促進(jìn)生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗用的豬生物發(fā)酵床保育期墊料取自湖北省桑梓湖種豬場。

1.1.1 培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；篩選效應(yīng)細(xì)菌培養(yǎng)基為明膠液化培養(yǎng)基、油脂水解培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基、纖維素降解培養(yǎng)基。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型），北京百泰克生物技術(shù)有限公司；AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit（Axygep，USA）；dNTPs、Taq DNA polymerase、DNA marker DL2000，均為北京莊盟國際生物基因科技有限公司；pMD18-T vector，大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 取豬生物發(fā)酵床保育期墊料樣品，4℃保存，3～5 d完成樣品的預(yù)處理和分離，保存菌種。

1.2.2 細(xì)菌分離純化 將樣品做梯度稀釋，無菌操作接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24～72 h，結(jié)合鏡檢，并對數(shù)量優(yōu)勢的細(xì)菌純培養(yǎng)，保存菌株備用。

1.2.3 效應(yīng)細(xì)菌的篩選

1.2.3.1 淀粉水解試驗 將待測菌株點種于淀粉水解培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)36 h，滴入幾滴盧哥氏碘液，若菌落附近出現(xiàn)無色透明水解圈，說明淀粉被水解，透明圈越大，菌株水解淀粉的能力越強（凌云，2004）。菌株水解能力計算公式：

式中，Up為菌株水解能力；D為透明圈直徑平均值，mm；d為菌落直徑的平均值，mm。

1.2.3.2 明膠液化試驗 將待測菌株穿刺接種于明膠液化培養(yǎng)基中，20℃分別培養(yǎng) 3 d后，取出，觀察并記錄明膠液化高度。

1.2.3.3 油脂水解試驗 將待測菌株點種于油脂水解培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)60 h，觀察培養(yǎng)基上是否出現(xiàn)紅色斑點，若出現(xiàn)表明油脂被水解，為陽性，記為“+”，反之為陰性，記為“-”。

1.2.3.4 纖維素降解試驗 將菌株接種于纖維素降解培養(yǎng)基，同時設(shè)空白對照，37℃培養(yǎng)30 d，每5 d觀察1次。若濾紙條變薄、折斷或分解為一團，表明菌株具有分解纖維素的能力，反之不能分解纖維素（Mandels和 Sternberg，1985）。

1.2.4 效應(yīng)細(xì)菌屬的鑒定 根據(jù)細(xì)菌菌落特征與個體形態(tài)、染色及生理生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定，以確定菌株屬別。具體方法有革蘭氏染色、V.P試驗、M.R試驗、淀粉水解試驗、明膠液化試驗、油脂水解試驗、纖維素降解試驗、H2S試驗、吲哚試驗、硝酸還原試驗、氮源利用試驗和碳源利用試驗（東秀珠和蔡妙英，2001；程麗娟等，2000；布坎南，1984）。

1.2.5 效應(yīng)細(xì)菌種的鑒定 效應(yīng)細(xì)菌種的鑒定用16S rRNA基因序列分析法，即用細(xì)菌通用引物27 F和1492 R對效應(yīng)細(xì)菌近全長16S rDNA片斷PCR擴增。正向引物27 F序列為5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，反向引物1492 R序列為5’-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’（Dojka 等，1998）。 PCR 反應(yīng)總體系為 50 μL： 4 μL 2 mmoL/L dNTPs，5 μL 10×PCR buffer（含 Mg2+），1U Taq DNA polymerase，1 μL 基因組DNA，正、反向引物各 1×10-5μmol，其余用 ddH2O補充。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 40 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，28個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴增后，取1 μL上樣緩沖液和5 μL PCR擴增產(chǎn)物，混合后點樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，同時點5 μL DNA Marker DL 2000作為參照。120 V電泳30 min后，溴化乙錠染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察、拍照、存盤。然后將PCR產(chǎn)物回收純化后克隆到載體pMD18-T vector上，挑取DH5α陽性克隆，委托北京奧克生物科技有限公司測序，將所得序列用軟件DNAStar校對，并在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行序列blast相似度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離純化 在稀釋度為10-5時，細(xì)菌菌落長勢較好，分布均勻且較為獨立，共獲得細(xì)菌30株，記為 B1～ B30。

2.2 效應(yīng)細(xì)菌的篩選

2.2.1 淀粉水解試驗 由圖1可知，不同細(xì)菌菌株水解淀粉的能力不同，能夠水解淀粉的細(xì)菌有9 株，其中 B6、B15、B29水解淀粉的能力較強（與平均值相比），其余菌株水解淀粉的能力較弱。

2.2.2 蛋白質(zhì)水解試驗 由圖2可知，不同細(xì)菌菌株水解蛋白質(zhì)的能力不同，能夠水解蛋白質(zhì)的細(xì)菌有 12 株， 其中B4、B6、B10、B12、B29水解蛋白質(zhì)能力較強（與平均值相比），其余菌株水解蛋白質(zhì)的能力較弱。

2.2.3 油脂水解試驗 能夠水解油脂的細(xì)菌菌株有12 株（B1、B4、B7、B8、B10、B12、B19、B21、B23、B24、B26、B27），占細(xì)菌總數(shù)的40%，其余菌株無水解油脂的能力。

2.2.4 纖維素降解試驗 將待測菌株接種于纖維素降解培養(yǎng)基，每5 d觀察1次，30 d后，只有B4、B6、B10、B12將濾紙變薄，說明纖維素被分解，其余菌株沒有降解纖維素的能力。

上述結(jié)果表明，在分離菌株中，B4菌株降解蛋白質(zhì)的能力較強在平均值以上，同時也具有分解油脂和纖維素的能力；B6降解蛋白質(zhì)能力最強，降解淀粉的能力較強，同時也能降解纖維素；B10對蛋白質(zhì)水解能力較強，對淀粉水解能力不強，在平均值以下，同時兼有降解油脂和纖維素能力；B12降解蛋白質(zhì)的能力較強，兼有降解油脂和纖維素的能力；B15水解淀粉的能力最強，但是不具備降解蛋白質(zhì)、油脂和纖維素的能力；B29水解淀粉和蛋白質(zhì)的能力均較強。因此這6株細(xì)菌綜合降解有機質(zhì)的能力較強，在豬生物發(fā)酵床保育期墊料有機物的降解過程中可能發(fā)揮重要作用，是本研究篩選出的效應(yīng)菌株。

2.3 效應(yīng)細(xì)菌屬的鑒定 根據(jù)菌落特征與個體形態(tài)、染色及生理生化鑒定結(jié)果（表1），最終確定效應(yīng)細(xì)菌菌株 B4、B6、B10、B15為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.），B12為沙雷菌屬 （Serratia sp.），B29為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。

表1 效應(yīng)細(xì)菌形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果

2.4 效應(yīng)細(xì)菌種的鑒定

2.4.1 效應(yīng)細(xì)菌基因組總DNA提取 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取效應(yīng)細(xì)菌的基因組總DNA。結(jié)果表明，提取的DNA完整、無拖尾和雜帶（圖 3）。

2.4.2 效應(yīng)細(xì)菌近全長16S rRNA擴增 用細(xì)菌通用引物27 F和1492 R擴增效應(yīng)細(xì)菌16S rRNA基因片段，目標(biāo)片段約為1500 bp。結(jié)果表明，擴增條帶較亮，大小符合預(yù)期（圖4）。

將目的條帶回收、純化、克隆和測序，最終得到效應(yīng)細(xì)菌的16S rRNA序列。將所得基因序列用軟件DNAStar校對后，提交到NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行 Blast比較，選擇與GenBank中核苷酸序列相似度最高的菌株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些序列分別與已知的假單胞桿菌（Pseudomonas）、枯草芽孢 桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）和粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）的基因序列有98%、99%、99%、99%、100%和100%的相似率。結(jié)合菌落特征與個體形態(tài)、染色及生理生化鑒定結(jié)果，可以確定 B4、B6、B10、B12、B15、B29分 別 為 枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilis）、 嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）、 地 衣 芽 孢 桿 菌 （Bacillus licheniformis）、 粘 質(zhì) 沙 雷 氏 菌 （Serratia marcescens）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和假單胞桿菌（Pseudomonas）。

3 討論

微生物的種屬鑒定是深入認(rèn)識微生物的重要環(huán)節(jié)，然而傳統(tǒng)的根據(jù)菌落特征與個體形態(tài)、染色及生理生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定的方法，只能將微生物鑒定到屬，極少數(shù)鑒定到種，加之，目前環(huán)境中可培養(yǎng)的微生物不足0.1%～1%，以及生理生化鑒定具有可變性，因此傳統(tǒng)的鑒定方法有一定的局限性（Torsvik 等，1996；Ward 等，1990）。 目前 16S rRNA基因序列分析法彌補了這一缺陷。細(xì)菌16S rRNA基因，約為1540 bp，信息量豐富，且有種的特異性，是細(xì)菌染色體上最保守的基因（Gurtle等，1991）。利用16S rRNA基因序列分析法幾乎可以鑒定所有的細(xì)菌，而且特異性強、穩(wěn)定性好、效率高、成本低，對環(huán)境微生物種屬鑒定具有重要意義。

本研究分離出的效應(yīng)細(xì)菌中，大部分為芽孢桿菌屬細(xì)菌。芽孢桿菌屬細(xì)菌在環(huán)境中以內(nèi)生孢子存在，為非致病性菌，可以分泌多種酶類，在發(fā)酵床墊料有機質(zhì)分解過程中，發(fā)揮重要作用（李野等，2005）。研究表明，枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌不僅能高效降解豬排泄物和墊料中的有機質(zhì)，還能產(chǎn)生抗生素，抑制病原菌的繁殖，改善生態(tài)環(huán)境（武亮，2010）。地衣芽孢桿菌被豬只舔食后，進(jìn)入消化道能促進(jìn)腸道內(nèi)正常生理性厭氧菌的生長，調(diào)整腸道菌群失調(diào)，恢復(fù)腸道功能，提高飼料利用率，增強豬的免疫力等。另外，本研究還分離出了粘滯沙雷氏菌和假單胞桿菌2株條件致病菌，它們在豬生物發(fā)酵床墊料中的作用以及對豬只的影響，仍需要進(jìn)一步研究。

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