吳則東 ，王華忠 ，倪洪濤

（1.黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室/黑龍江大學，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學院甜菜研究所/黑龍江大學農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；3.中國農(nóng)業(yè)科學院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室，哈爾濱150080；4.黑龍江大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150080）

近些年來，分子生物學發(fā)展較快，分子生物學技術(shù)也已經(jīng)廣泛地應用到作物的多個領(lǐng)域，例如種子純度的鑒定[1]、構(gòu)建指紋圖譜[2－3]、遺傳多樣性分析[4]、遺傳圖譜的構(gòu)建[5－6]以及植物數(shù)量性狀位點的定位[5]等等，但這一切都有賴于植物基因組DNA的提取。從目前的發(fā)展來看，植物基因組DNA的提取主要有SDS法和CTAB法，雖然還有一些試劑盒可以直接用于植物DNA的提取，但是這些方法一般都是步驟較多，要用到很多藥品，提取過程相對復雜，而且還要用到一些有毒的試劑。而甜菜作為世界兩大糖料作物之一，這些年來分子生物學方面也得到了很大的發(fā)展，目前文獻報道的甜菜基因組DNA提取主要是利用SDS以及CTAB對甜菜葉片進行提取，而利用堿裂解法對甜菜大群體進行基因組DNA的提取還沒有相關(guān)的報道，目前見諸文獻應用此種方法提取基因組DNA主要是玉米[7-10]、高粱[11]、水稻[12]等作物。本實驗嘗試利用NaOH對甜菜干種子進行DNA的提取，旨在建立一種快速提取甜菜大群體DNA的方法，為將來快速鑒定甜菜品種純度以及真實性打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

供試材料為黑龍江大學農(nóng)作物研究院遺傳改良重點實驗室提供的4個甜菜品系，分別是二倍體遺傳單胚細胞質(zhì)雄性不育系JV7，JV9和JV11，以及1個四倍體品系TB401。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 實驗中所用的試劑 0.5M的NaOH（現(xiàn)用現(xiàn)配）；瓊脂糖；上樣緩沖液：0.125%的溴酚藍，0.125%的二甲苯青FF，40%的蔗糖；無水乙醇；丙烯酰胺；甲叉雙丙烯酰胺；硝酸銀；NaOH；甲醛。

1.2.2 實驗中所用的儀器 伯樂電泳儀；JY-SPAT型水平電泳槽；北京六一的DYCZ-30型電泳槽；離心機。

1.3 DNA的提取

采用張明永及郭景倫等人[7，10，13]的方法，略加改動，采用4種方法進行甜菜干種子DNA的提取，每種方法均取每個樣品的1～3粒干種子（單胚種子3粒，多胚四倍體種子1粒），大約30mg，不同方法前處理不同。①利用100μL 0.5M的NaOH對胚進行研磨，研磨后倒入1.5mL的離心管中，10000r/min離心5min，取出上清液，用100μL無水乙醇洗滌，倒掉上清液，待乙醇揮發(fā)后，加入100μL TE緩沖液，-20℃保存；②利用100μL 0.5M的NaOH對種子直接進行研磨，其它與①相同；③先將干種子的胚取出，打碎后，放入1.5mL的離心管中，再加入100μL 0.5M的NaOH，上下顛倒使NaOH溶液充分浸入到甜菜胚的粉末中去，然后再沸水浴5min，冷卻至室溫后，10000r/min離心5min，取出上清液，用100μL無水乙醇洗滌，倒掉上清液，待乙醇揮發(fā)后，加入100μL TE緩沖液，4℃保存；④將種子直接研磨成粉末，放入1.5mL的離心管中，再加入100μL 0.5M的NaOH，其余步驟與③相同。

1.4 DNA質(zhì)量與數(shù)量的檢測

取5μL DNA樣品與1μL上樣緩沖液，利用離心機將其混勻，利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性（電泳緩沖液為0.5×TBE）。同時，加入已知濃度的Lambda DNA，估算DNA樣品的濃度。

1.5 SSR反應

⑴SSR引物：本實驗中所用的SSR引物來源于文獻[14-17]，引物由上海生工生物工程公司合成。

⑵SSR反應體系：將提取的DNA稀釋到10ng/μL，在20μL反應體系中包括模板DNA 4μL，2×Taq PCR master mix 10μL，正反向引物各60ng，其余用無菌雙蒸水補充。

⑶SSR反應程序：擴增反應在PTC-100上進行，反應程序為：94℃預變性3min，1個循環(huán)；94℃變性50s，52℃退火 50s，72℃延伸 50s，32個循環(huán)；72℃延伸 10min，最后 4℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的檢測及純度鑒定

從干種子中提取的DNA利用0.8%的瓊脂糖進行檢測，同時利用Lambda DNA進行定量分析，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，4種方法均從甜菜干種子提取出了DNA，DNA的完整性都很好，而且RNA含量較低；從提取的DNA含量來看，利用NaOH直接研磨胚及種子提取的DNA含量相差不大，從提取的DNA與Lambda DNA對比結(jié)果來看，利用堿直接研磨不經(jīng)水沸每30mg干種子大約提取DNA 600ng；對種子和胚研磨后加NaOH再水沸的結(jié)果見圖中后兩組，從圖中我們可以看出，干種子直接研磨處理效果非常好，從與Lambda DNA對比結(jié)果來看，每30mg干種子提取DNA超過 1μg；而胚研磨水沸的效果則比較差，是4種方法中提取DNA最少的一種，含量較低。

圖1 4種方法提取DNA瓊脂糖檢測結(jié)果

2.2 SSR結(jié)果分析

利用提取DNA量最多的第四種方法獲得的DNA對前3個單胚樣品進行SSR-PCR分析，并利用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行檢測，銀染結(jié)果見圖2。從圖2我們可以看出，利用NaOH提取的甜菜干種子DNA，雖然減少了很多常規(guī)提取DNA的環(huán)節(jié)，里面有些雜質(zhì)也沒有完全去除干凈，但依然能夠擴增出清晰的條帶，完全能夠滿足SSR擴增的需要。

圖2 8%聚丙烯酰胺凝膠銀染圖

3 討論

本實驗利用堿裂解法首次從甜菜干種子中提取到了DNA，通過不同提取方法的對比，確立了先對種子進行研磨，然后再加NaOH溶液，沸水處理5min為最佳提取甜菜大群體DNA的方法。本方法僅使用2～3粒甜菜單胚種子就可以在10幾分鐘的時間內(nèi)提取到超過1μg的DNA，而且提取的DNA完整性好，RNA含量極低，能很好地應用于SSR反應，因為應用本方法不需要使用液氮以及有毒的氯仿、苯酚等等，由于是直接使用干種子進行DNA的提取，所以也省去了種子發(fā)芽或者利用真空冷凍干燥機[18]對葉片的處理，另外由于甜菜種子研磨比較容易，所以不需要使用粉碎機[19]或者電鉆[20]進行種子的粉碎，實驗方法大大的簡化。將來隨著甜菜分子指紋圖譜的建立，一個普通的分子實驗室完全可以在一天內(nèi)僅僅利用甜菜種子就可以對上百份樣品完成品種的純度及真?zhèn)蔚蔫b定。本方法由于其簡單、易操作、步驟少等優(yōu)點能夠更好地促進甜菜分子生物學向?qū)嵱眯陨峡焖侔l(fā)展。

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