李莉 李祎群 孫玉姣

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院中醫(yī)科，上海 200127)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特征是持續(xù)存在的氣流受限，氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展。氧化與抗氧化失衡是COPD的重要發(fā)病機(jī)制，該機(jī)制認(rèn)為，自由基及活性氧生成過多或清除不足將導(dǎo)致機(jī)體氧化與抗氧化失衡［1］。淫羊藿苷是中藥淫羊藿的主要活性成分?，F(xiàn)代藥理研究［2］發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷具有抗氧化作用，對(duì)羥自由基、超氧陰離子等有較強(qiáng)的清除和抑制作用，可減輕自由基對(duì)機(jī)體的損傷。本研究采用煙熏聯(lián)合氣管內(nèi)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)滴入方法建立COPD大鼠模型，并給予淫羊藿苷處理，觀察淫羊藿苷對(duì)COPD大鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力的影響。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量(200±10)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器 淫羊藿苷(陜西慧科植物開發(fā)有限公司);LPS(美國(guó)Sigma公司);潑尼松(上海信誼藥廠有限公司);SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所);總蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 分組 50只大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。A組為健康對(duì)照組，B組為COPD模型組，C組為淫羊藿苷治療組，D組為潑尼松治療組，E組為淫羊藿苷加潑尼松治療組。A組大鼠正常飼養(yǎng)，不給予任何處理，B、C、D、E 組大鼠參照文獻(xiàn)［3］建立大鼠COPD模型，于第1、17天在大鼠氣管內(nèi)注入 LPS 200 μg;第2～39天讓大鼠在容積為100 L的密閉箱內(nèi)被動(dòng)吸煙，3支/次，密閉30 min，打開密閉箱透氣15 min，每天重復(fù)上述過程4次。第17天不予被動(dòng)吸煙。自實(shí)驗(yàn)第1天起，B、C、D、E組大鼠每天在被動(dòng)吸煙前給予灌胃治療:B組用蒸餾水10 mL/kg，C組用淫羊藿苷100 mg/kg，D組用潑尼松5 mg/kg，E組用淫羊藿苷50 mg/kg加潑尼松2.5 mg/kg。

1.4 標(biāo)本采集 第40天用25%烏拉坦4 mL/kg麻醉大鼠，打開腹腔，從股動(dòng)脈取血4 mL，室溫下靜置1 h，3000 r/min離心 15 min，取上清液，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。打開胸腔，分離肺組織，置于冰上，取0.1 ～0.2 g 肺組織，用冷的 0.9%氯化鈉溶液洗滌以除去表面血液，濾紙拭干，稱質(zhì)量，與冷的0.9%氯化鈉溶液按質(zhì)量體積比1∶9制成10%的肺組織勻漿，2000 r/min離心10 min，取上清液，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 SOD活力測(cè)定 用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定外周血及肺組織勻漿中SOD的活力，具體操作按試劑盒說明。

1.6 大鼠肺組織病理形態(tài)觀察 隨機(jī)切取部分右肺組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。各組SOD活力比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肺組織切片的病理觀察 A組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁無炎性細(xì)胞浸潤(rùn);B組肺泡壁及肺間隔炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間隔斷裂、融合，肺實(shí)質(zhì)破壞，形成廣泛性肺氣腫;C組肺泡壁及肺間隔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肺泡腔擴(kuò)大，部分出現(xiàn)融合，但肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞程度輕;D組肺組織病理改變近似A組，肺泡壁及肺間隔少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，少數(shù)肺泡間隔斷裂、融合，形成局限性肺氣腫;E組改變介于C組與D組之間，肺泡腔擴(kuò)大，肺間隔斷裂、融合不明顯，肺組織炎性浸潤(rùn)明顯輕于C組明顯減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠的肺組織切片的病理結(jié)果(HE，×100)

2.2 各組大鼠肺組織勻漿和外周血中SOD活力比較 見表1。

表1 各組大鼠肺組織勻漿和外周血中SOD活力比較()

表1 各組大鼠肺組織勻漿和外周血中SOD活力比較()

注:與 A 組比較，*P ＜0.01;與 B 組比較，▲P ＜0.05

3 討 論

吸煙是COPD的主要危險(xiǎn)因素。香煙煙霧中的有害物質(zhì)繁多，包括活性氧(ROS)、活性氮、活性醛類和醌類等等。香煙中的焦油含有醌和半醌類的自由基，能與氧快速進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，生成大量的活性氧，如超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫等。這些活性氧及自由基能通過活化NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑，介導(dǎo)促炎性基因轉(zhuǎn)錄，生成大量促炎性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)肺內(nèi)發(fā)生炎性反應(yīng);自由基還能活化多種炎性細(xì)胞，增加氣道黏液，改變體內(nèi)蛋白酶/抗蛋白酶的平衡而損傷肺實(shí)質(zhì)，破壞肺泡壁結(jié)構(gòu)［4］。LPS是革蘭陰性菌的外膜結(jié)構(gòu)，是重要的致炎因子，可直接引起氣道上皮損傷，導(dǎo)致各種炎性細(xì)胞的激活和細(xì)胞因子的釋放，誘發(fā)氣道炎性反應(yīng)。本研究采用煙熏聯(lián)合氣管內(nèi)LPS滴入的方法建立大鼠COPD模型。與健康對(duì)照組比較，模型組大鼠肺泡壁及肺間隔內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間隔斷裂、融合，肺泡腔融合擴(kuò)大，形成肺氣腫樣改變，符合COPD的形態(tài)學(xué)改變，提示COPD模型造模成功。

SOD是體內(nèi)重要的抗氧化劑，是人體唯一能催化超氧陰離子生成過氧化氫的酶。SOD活力的高低能反映機(jī)體清除自由基的能力。吸煙者及COPD患者體內(nèi)SOD的表達(dá)及活力均較低，而SOD活力低下時(shí)可能會(huì)誘發(fā)COPD［5-6］。肺組織勻漿中SOD活力可反映局部組織對(duì)自由基的清除能力，外周血SOD活力則反映了整個(gè)機(jī)體對(duì)自由基的清除能力。

本研究發(fā)現(xiàn)，與A組大鼠比較，B組大鼠肺組織勻漿及外周血中SOD的活力均顯著下降(P＜0.01)，提示COPD模型大鼠肺組織局部及整體均處于氧化失衡狀態(tài)，SOD活力明顯不足，自由基清除能力減弱，致大鼠肺組織呈肺氣腫樣改變。淫羊藿苷是中國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)益藥淫羊藿的主要活性成分。其可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)超氧陰離子、羥自由基等的清除能力。本研究發(fā)現(xiàn)，與B組比較，C組大鼠肺組織勻漿的SOD活力下降較少(P＜0.05);外周血SOD活力呈下降趨勢(shì)，但與A組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。C組大鼠肺泡壁及肺間隔以炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主，肺泡腔擴(kuò)大，部分肺間隔斷裂、融合，呈肺氣腫改變，提示COPD肺組織氧化失衡嚴(yán)重;D組大鼠肺組織勻漿及外周血SOD活力亦顯著下降，與B組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但大鼠只有部分肺組織的肺間隔呈現(xiàn)斷裂、融合以及局限性肺氣腫改變，程度及范圍顯著輕于B組，肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度顯著輕于C組，提示SOD活力不足;E組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變介于C組與D組之間，E組肺組織勻漿及外周血SOD活力下降與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其可能的原因是:雖然淫羊藿苷應(yīng)用劑量減半，對(duì)肺組織局部及整體的自由基的清除能力減弱，但聯(lián)合應(yīng)用的潑尼松可能產(chǎn)生了協(xié)同作用，這樣既能減輕COPD的炎性反應(yīng)，又減少了激素應(yīng)用量。

綜上所述，淫羊藿苷能增加SOD活力，減輕自由基對(duì)肺組織的損傷，對(duì)香煙誘導(dǎo)COPD的形成有一定的阻止作用。淫羊藿苷與糖皮質(zhì)激素類藥物具有協(xié)同作用，兩者聯(lián)合應(yīng)用能減少激素用量。

［1］ 蔡柏薔.慢性阻塞性肺疾病診斷、處理和預(yù)防全球策略(2011年修訂版)解讀［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2012，35(4):249-256.

［2］ Zeng KW，F(xiàn)u H，Liu GX，et al.Icariin attenuates lipopolysaccharide-induced microglial activation and resultant death of neurons by inhibiting TAK1/IKK/NF-kappaB and JNK/p38 MAPK pathways［J］.Int Immunopharmacol，2010，10(6):668-678.

［3］ 宋一平，崔德健，茅培英.慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立及藥物干預(yù)的影響［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，22(2):99-102.

［4］ Rahman I.Pharmacological antioxidant strategies as therapeutic interventions for COPD ［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1822(5):714-728.

［5］ Monta?o M，Cisneros J，Ramírez-Venegas A，et al.Malondialdehyde and superoxide dismutase correlate with FEV(1)in patients with COPD associated with wood smoke exposure and tobacco smoking［J］.Inhalat Toxicol，2010，22(10):868-874.

［6］ Tanaka K，Sato K，Aoshiba K，et al.Superiority of PC-SOD to other anti-COPD drugs for elastase-induced emphysema and alteration in lung mechanics and respiratory function in mice［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2012，302(12):L1250-1261.