徐沁同 陳增淦 張鍵 周建平 張峰 陳統(tǒng)一 姚文華 李慶利 劉洪英 張人

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨科，上海 200032;2.復(fù)旦大學(xué)分析測試中心，上海 200433;3.華東師范大學(xué)極化材料與器件實驗室，上海 200241)

周圍神經(jīng)中的神經(jīng)纖維顯微結(jié)構(gòu)歷來是研究熱點之一。過去對于周圍神經(jīng)纖維的顯微結(jié)構(gòu)研究大多注重于組織化學(xué)染色、免疫熒光方法等，對神經(jīng)的物理學(xué)性質(zhì)認識較少，其實，物質(zhì)的物理學(xué)特性最容易直接地被識別。

隨著光學(xué)技術(shù)的不斷進步和成熟，光譜在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用越發(fā)受到重視。拉曼光譜(Raman spectroscopy)能夠給出物質(zhì)的深層次信息，最初應(yīng)用于有機化學(xué)和材料分析。而超光譜成像具有實時、快速、不破壞細胞、敏感性高、分辨率高、能夠定性定量等優(yōu)勢。目前，已經(jīng)確認，顯微拉曼光譜可以區(qū)分同種組織的腫瘤細胞［1-3］、干細胞［4-5］、炎性反應(yīng)［6］以及不同組織的細胞［7］等。超光譜成像技術(shù)能同時提供生物組織樣本圖像和光譜兩方面的信息，能對檢測標本進行定性、定量和定位的描述，是具有潛力的新興成像和檢測技術(shù)［8］。目前，超光譜成像技術(shù)已被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如生物組織的血色素檢測［9］，糖尿病足［10］、糖尿病的視網(wǎng)膜病變［11］以及各種腫瘤［12-15］的診斷隨訪，中醫(yī)舌診［16］等。

本文應(yīng)用顯微拉曼光譜和分子超光譜成像對周圍神經(jīng)的顯微結(jié)構(gòu)進行研究，旨在為應(yīng)用光譜技術(shù)對周圍神經(jīng)的各種研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 取材 取成年普通級新西蘭大白兔10只(體質(zhì)量約2.5 kg，雌雄不限)，空氣靜脈注射處死后迅速解剖，顯露椎管和硬膜，分離雙側(cè)骶1脊神經(jīng)前根和后根，于神經(jīng)根起始端1 mm處用彈簧剪刀剪斷，剪取5～8 mm標本，置于包埋液中，液氮快速冷凍，于-80℃冰箱貯藏。

1.2 儀器設(shè)備與試劑 激光共聚焦顯微拉曼光譜儀購自法國HORIBA Jobin Yvon公司(激光波長632.8 nm，功率4.3 mW，激光光斑直徑 0.7 μm)，分子超光譜成像系統(tǒng)由華東師范大學(xué)極化材料與器件實驗室提供，Leica CM1850型冷凍切片機購自德國Leica公司。分子超光譜成像系統(tǒng)的操作方法詳見參考文獻［11］。

1.3 方法

1.3.1 切片制作 不對標本進行固定處理，于-20℃下直接作橫斷面冷凍切片，拉曼光譜研究采用30 μm厚度的切片，超光譜成像研究采用10 μm厚度的切片，切片后直接貼片。

1.3.2 拉曼光譜采集和分析 將切片置于高倍光鏡(×400)下，隨機選取直徑超過1 μm的軸突斷面，用激光共聚焦顯微拉曼光譜儀進行顯微拉曼光譜采集，采集時間50 s;光譜采集條件:波數(shù)范圍400～3600 cm-1。在相同參數(shù)下取同一切片空白處的掃描背景作對照。原始數(shù)據(jù)經(jīng)LabSpec 3.0人工基線處理和計算機多項式迭代法平滑曲線后獲得最終用于數(shù)據(jù)分析的顯微拉曼光譜。

1.3.3 超光譜成像和數(shù)據(jù)分析 采用分子超光譜成像系統(tǒng)，將切片置于低倍光鏡(×20)下，在固定波段+非積分連續(xù)采集模式下調(diào)至清晰顯示后，采集模式設(shè)為積分方式+連續(xù)采集模式，設(shè)置掃描頻率178 MHz，頻率間隔1 MHz，采集80個波段，保存系統(tǒng)采集樣本圖像數(shù)據(jù)，在相同參數(shù)下取同一切片空白處掃描的背景作對照。用ENVI(environment for visualizing images)4.7在完成校正的光譜文件中選取一個視野清晰的波段，在神經(jīng)切片的斷面圖像上選取軸突中任意一點，圈取感興趣區(qū)域(regions of interest，ROI)，即可獲得該區(qū)域的平均光譜信號。每個切片標本圈取15個ROI，避開直徑小于1 μm的神經(jīng)纖維，應(yīng)用環(huán)境可視化圖像ENVI計算平均光譜曲線。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差()表示，對峰值比值采用t檢驗和聚類分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 周圍神經(jīng)的顯微拉曼光譜

2.1.1 周圍神經(jīng)纖維的拉曼光譜基本特點經(jīng)過計算機平滑和基線處理后，脊髓前根和后根切片標本均在 550 cm-1、1080 cm-1、1280 cm-1、1440 cm-1、1660 cm-1附近表現(xiàn)出強度明顯的拉曼強度，而其中一般以1440 cm-1處的拉曼強度為最高。見圖1。

圖1 脊髓前根和后根的顯微拉曼光譜(×400)

550～660 cm-1屬于各種鹵代烷類的C-X伸縮;1080 cm-1、1110 cm-1可能為碳水化合物的振動;1440 cm-1為C-H變形振動，屬于類脂物質(zhì);1280 cm-1和1660 cm-1峰分別起源于由C=O基團和N-H基團所形成的酰胺III和酰胺I譜帶，屬于蛋白質(zhì)的吸收峰，反映了蛋白質(zhì)的含量。2700～3000 cm-1峰為CH伸縮振動，反映了神經(jīng)纖維中的脂類，而3000～3400 cm-1為鏡檢時所添加的水溶液媒介引起。2700～3400 cm-1信號在不同標本中的差異很大且缺乏規(guī)律表現(xiàn)。選取 550 cm-1、1080 cm-1、1280 cm-1、1440 cm-1、1660 cm-1處的強度(± 15cm-1內(nèi)取最大強度)進行主成分分析，見各峰值貢獻率均較高。見表1。

表1 染色前脊髓前后根拉曼強度主成分分析

在各拉曼強度中I1440數(shù)值最大，提示一次合格的神經(jīng)纖維的顯微拉曼光譜采集需要在1440 cm-1處有明顯的峰強讀數(shù)。

2.1.2 運動和感覺神經(jīng)纖維拉曼光譜的區(qū)別 對550 cm-1、1080 cm-1、1280 cm-1、1660 cm-1處與1440 cm-1處拉曼強度的比值分別進行獨立樣本的t檢驗，結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。根據(jù)拉曼強度比值進行聚類分析認為，運動和感覺神經(jīng)纖維的信號相似，見圖2。

表2 染色前脊髓前后根拉曼強度比值

2.2 周圍神經(jīng)的超光譜成像

2.2.1 周圍神經(jīng)斷面的超光譜基本特征 根據(jù)計算得到的平均曲線分析，運動與感覺纖維軸突的超光譜曲線相似，但髓鞘表現(xiàn)出的信號與軸突截然不同，見圖3。

2.2.2 周圍神經(jīng)纖維髓鞘的超光譜成像識別 由于髓鞘信號與軸突信號差異很大，采用光譜角度匹配法(spectral angle mapper，SAM)，可直接將無色的髓鞘和感覺或運動神經(jīng)纖維的軸突進行區(qū)分，并擬就偽彩色圖像，從而可以清晰地顯示包裹在軸突外的髓鞘，見圖4。

圖4 SAM處理后擬合生成的偽彩色圖像(×20)

3 討 論

近年來，國內(nèi)外開始應(yīng)用顯微拉曼光譜對生物學(xué)物質(zhì)分析研究。目前，拉曼光譜大多用于鑒別不同組織學(xué)特性的細胞，對不同功能、組織學(xué)特征相近細胞的研究則較少見。有研究［17］用光譜識別腫瘤細胞，這是因為腫瘤細胞在增殖過程中，腫瘤細胞內(nèi)核酸和脂質(zhì)發(fā)生改變而被識別［17］。

顯微拉曼光譜對研究周圍神經(jīng)標本具有一定優(yōu)勢。首先，拉曼光譜技術(shù)對于被測樣品的制備無特殊要求，樣品可以是細胞懸液，也可以是經(jīng)過固定或者經(jīng)過各種染色的細胞;其次，低能量的激光波長對于待測樣品幾乎無損傷，并且能夠?qū)崿F(xiàn)對樣品的實時檢測［18］;第三，水對可見光吸收很弱，因此應(yīng)用拉曼光譜較紅外光譜更適合對需要保持濕潤的周圍神經(jīng)標本進行研究，但顯微拉曼光譜用于周圍神經(jīng)研究也有不足之處，例如，周圍神經(jīng)纖維相似成分的分子數(shù)量遠大于特異性蛋白的分子數(shù)量，這些特異性分子的拉曼信號常被整體信號掩蓋，從而無法在光譜中直接讀出。因此，在未作任何處理的原始狀態(tài)下，最終獲得的兩種神經(jīng)纖維的顯微拉曼信號之間無顯著差異。

本研究未發(fā)現(xiàn)兩種周圍神經(jīng)纖維的拉曼信號有差異，而各條光譜曲線卻又完全不同。根據(jù)應(yīng)用拉曼光譜檢測生物標本的經(jīng)驗來看，生物樣品的拉曼信號極為復(fù)雜，拉曼強度受掃描范圍內(nèi)被測物質(zhì)密度、結(jié)構(gòu)組成以及雜質(zhì)等各種因素影響，導(dǎo)致即使同一位置兩次測量的光譜信號之間也會存在一定微小偏差。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同功能的神經(jīng)切片樣品本身的光譜差異同樣十分微小，通過細微的信號差異進行組織學(xué)上的識別非常困難。如果能對周圍神經(jīng)纖維的拉曼光譜進行一定的修飾，則有可能將運動與感覺神經(jīng)纖維加以區(qū)分。通過髓鞘染色來觀察正常和病理情況下髓鞘是否完整，有無變性、壞死及修復(fù)情況，對神經(jīng)組織的病理診斷和研究有實用意義。目前關(guān)于髓鞘的研究主要依賴染色方法，大致有以下幾種:蘇丹黑法［19］、重鉻酸鉀法［20］、Luxol fast blue法［21］、銀染色法［22］等。這些方法普遍存在染色時間長以及缺少對比度和特異性的缺點。同時，在石蠟切片時，髓鞘中的類脂質(zhì)容易被溶解，其形態(tài)特點及成分受到影響，難以顯示真實形態(tài)?？傊?，在分子超光譜成像方法問世之前尚無一種簡單而又敏感的方法可供基礎(chǔ)研究以及臨床檢測應(yīng)用［23］。

本研究采用的分子超光譜成像方法對于分析冷凍切片具有很大的優(yōu)勢。首先，應(yīng)用分子超光譜成像分析髓鞘性質(zhì)，省去了繁瑣的染色過程和昂貴的試劑，直接進行數(shù)據(jù)分析也較好地維持了生物細胞的原始結(jié)構(gòu)和物質(zhì)成分。在過去的研究中，分子超光譜成像技術(shù)已經(jīng)展示了其能區(qū)分不同種類細胞的優(yōu)勢。軸突是神經(jīng)元細胞的一部分，其斷面包括了細胞質(zhì)、細胞器以及多種神經(jīng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)等物質(zhì)，而包繞其周圍的髓鞘則實為神經(jīng)膜細胞的質(zhì)膜沿著軸索的軸心螺旋纏繞形成的多層脂雙層結(jié)構(gòu)。本研究通過大量取樣，獲得了典型的髓鞘超光譜曲線，成功應(yīng)用該特征光譜曲線對神經(jīng)切片中的髓鞘組織進行了識別，通過計算機處理生成偽彩色圖像，比同樣將髓鞘顯色的染色后光鏡鏡檢方法更為快捷。本研究采用光譜角匹配法對光譜曲線進行區(qū)分。光譜角是指具有同樣波長范圍的2個像元向量在光譜空間上所形成的夾角，它可作為衡量光譜相似性的一個重要指標。2條曲線之間的光譜角越小，其余弦值也接近為1，說明兩光譜向量也相似，光譜特性越相近;反之，若光譜角越大，光譜之間的差異越大。本研究在ENVI軟件中設(shè)定一個角度α，光譜相似性小于此角度者被識別，其余信息都不被識別，由此完成光譜曲線信號的區(qū)分;其次，應(yīng)用分子超光譜成像能夠定性、定量地反映髓鞘性質(zhì)的改變。劉洪英等［11］率先應(yīng)用分子超光譜成像系統(tǒng)對促紅細胞生長素治療糖尿病視網(wǎng)膜病變進行了定量分析，提示分子超光譜成像系統(tǒng)可以作為一種新的手段對病理及藥物療效進行研究。髓鞘變性和脫髓鞘改變必然也具有各自典型的超光譜特征，通過對它們的進一步研究，可以了解正常髓鞘與病變髓鞘的超光譜曲線變化特點，此舉確好地發(fā)揮了超光譜成像在病理學(xué)、藥理學(xué)方面快速、可靠、定性、定量的優(yōu)勢。

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