張 怡，徐克東，陳佩佩，段素娟，孟 娉，喬月娥，李成偉

（周口師范學(xué)院 植物遺傳與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 周口 466000）

瓜類白粉病是一種世界性病害，在中國每年都因此病害造成大量減產(chǎn)［1］.單囊殼白粉菌（Sphaerothecafuliginea）和二孢白粉菌（Erysiphecichoracearum）是瓜類蔬菜白粉病的主要病原菌［2］，前者比后者更為常見［3－4］.瓜類白粉病在我國各地的保護(hù)地和露地各種瓜類上普遍發(fā)生.黃瓜、葫蘆、甜瓜、南瓜受害較重，冬瓜和西瓜次之，絲瓜抗病性較強(qiáng).此病一旦發(fā)生，擴(kuò)展蔓延很快，給生產(chǎn)造成巨大損失，一般年份減產(chǎn)10%左右，流行年份減產(chǎn)高達(dá)20%～40%.

傳統(tǒng)方法通常利用病菌的顯微形態(tài)對真菌進(jìn)行小種鑒定和分析.隨著分子技術(shù)的發(fā)展，rDNA序列非轉(zhuǎn)錄區(qū)的核糖體DNA 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（internal transcribed spacer，ITS）被廣泛應(yīng)用于真菌小種及進(jìn)化程度的研究.真菌核糖體基因是由18S、ITS1、5.8S、ITS2 和28S 頭尾串聯(lián)構(gòu)成的重復(fù)序列.18S、5.8S和28SrDNA 屬于轉(zhuǎn)錄區(qū)，與它們相比較，ITS1和ITS2作為非編碼區(qū)承受的進(jìn)化選擇壓力小，相對變化較大，在種間表現(xiàn)出較高的差異，具有廣泛的保守性和特異性，設(shè)計(jì)特異性引物克隆該序列用于植物病原菌的鑒定、檢測、病害診斷及防御等，已成為國際上廣泛使用的分子生物學(xué)方法［5－7］.

鑒此針對在河南周口市發(fā)現(xiàn)大面積的瓜類白粉病菌，對其進(jìn)行顯微形態(tài)學(xué)觀察、ITS序列鑒定、進(jìn)化樹分析，為瓜類白粉病菌的鑒定分類、系統(tǒng)進(jìn)化和防治奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與試劑

1.1 試驗(yàn)材料

黃瓜、甜瓜、葫蘆、南瓜白粉病病菌植株均取自周口師范學(xué)院校園.

1.2 主要試劑及儀器

2xTaq Master Mix 購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司，標(biāo)準(zhǔn)的分子量Marker購自東盛生物科技有限公司，其它試劑均為國產(chǎn)試劑.

2%CTAB抽提液：100 mmol Tris－HCl（pH 8.0），20 mmol EDTA（pH 8.0），1.5 mol NaCl，2%CTAB（W／V），4%PVP40（W／V），高壓滅菌，使用前加入2%β－巰基乙醇（V／V）；10%CTAB抽提液：100 mmol Tris－HCl（pH 8.0），20 mmol EDTA（pH 8.0），1.5 mol NaCl，10%CTAB（W／V），4%PVP40（W／V），高壓滅菌，使用前加入2%β－巰基乙醇（V／V）；二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）染色液（1 mg／mL ）：溶解100mgDAB于100mL水中（pH3.8）；固定液（無水乙醇：冰乙酸＝3∶1）；臺盼蘭染液：用0.85%的生理鹽水配制成0.3%的臺盼蘭染液；水合三氯乙醛（2.5g／mL）：溶解250g 三氯乙醛于100mL水中.

掃描電子顯微鏡為FEI公司的Quanta 200型產(chǎn)品，PCR 儀為Biometra公司T1型產(chǎn)品.

2 試驗(yàn)方法

2.1 白粉病菌的形態(tài)觀察

2.1.1 顯微形態(tài)觀察 對染病葉片的菌落顏色、大小、形狀進(jìn)行普通觀察，以及使用DAB 和臺盼蘭染色的方法進(jìn)行顯微鏡觀察［8］.

2.1.2 纖維狀體的觀察 取白粉病菌無性世代分生孢子于載玻片上，加1滴3%的KOH 溶液，蓋上蓋玻片，在10×40倍顯微鏡下觀察分生孢子上是否有纖維狀體［9］.

2.1.3 掃描電鏡觀察 剪取1.0×1.0cm2大小的葉片，經(jīng)真空鍍金后，在Quanta 200 型掃描電子顯微鏡的高真空環(huán)境下進(jìn)行觀察，參數(shù)設(shè)置如下：預(yù)設(shè)駐留時(shí)間為10μs，燈絲電壓為20.00KV.

2.2 病原菌的致病性檢測

從感染葉片上采集新鮮孢子，采用分生孢子懸浮液分別對黃瓜、甜瓜、葫蘆和南瓜葉片進(jìn)行接種，并以清水接種作為對照，培養(yǎng)約5d后，觀察記錄發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀進(jìn)行比較，并從葉片上再次分離病原菌，比較它們與自然發(fā)病分離出的病原菌的異同.

2.3 白粉病菌總DNA的提取、ITSrDNA序列的PCR擴(kuò)增

2.3.1 黃瓜、甜瓜、葫蘆和南瓜白粉病菌總DNA 的提取 采用改良的真菌DNA 提取方法提取白粉病菌的DNA［8］.

2.3.2 PCR 擴(kuò)增及測序 本實(shí)驗(yàn)的PCR 體系（20 μL體系）：ITS序列采用真菌核糖體區(qū)段通用引物ITS1（5’－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3’）和ITS4（5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’）.4種白粉病菌ITS擴(kuò)增體系均為：DNA 模板2μL，ITS1 2μL，ITS4 2μL，Mix 10μL，ddH2O 4μl.PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃，5 min；變性94℃，30s，退火48℃，45s，延伸72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；再延伸72℃，5min.

取6μL PCR 產(chǎn)物電泳，進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，在凝膠成像系統(tǒng)下檢測結(jié)果.將所得到的目的條帶經(jīng)PCR 產(chǎn)物純化試劑盒純化后，送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序.

2.4 ITS序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI的GenBank中對本研究的ITS序列和其他同源序列進(jìn)行比對分析其同源性，采用Clustal X 1.83）軟件中的Alignment程序?qū)Λ@得的所有序列進(jìn)行劃分、多重對位排列（Multiple alignments）.采用MEGA 5.02軟件做近鄰歸群法分析，用自展法（Bootstrap）對所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行檢測，自展重復(fù)次數(shù)設(shè)定為1 000次＞40%的支持強(qiáng)度，對其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和進(jìn)化樹的構(gòu)建.

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 白粉病菌的顯微形態(tài)觀察

經(jīng)DAB和臺盼蘭染色在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)4種瓜類白粉病的分生孢子均呈橢圓形，大小為25.64×15.64～29.36×19.23（μm）（圖1，A），串生在分生孢子梗上（圖1，B），但分生孢子梗上的分生孢子數(shù)目有所差異，大約有4～12 個(gè)分生孢子（表1）.在40倍顯微鏡下用3%的KOH 觀察到4種瓜類白粉病的分生孢子內(nèi)均有發(fā)達(dá)的纖維狀體（圖1，C）.初級芽管均從分生孢子側(cè)端萌發(fā)（圖1，D），但發(fā)現(xiàn)黃瓜白粉病菌也有從頂端萌發(fā)的現(xiàn)象（圖1，E）.4種瓜類白粉病子囊數(shù)均為1，且有8個(gè)子囊孢子.

表1 4種瓜類白粉病菌顯微形態(tài)比較Tab.1 Comparative analysis of morphology of four cucurbits powdery mildew pathogen

圖1 瓜類白粉病菌的顯微形態(tài)Fig.1 Morphology of cucurbits powdery mildew pathogen

3.2 病原菌的致病性檢測

采用分生孢子懸浮液對黃瓜、甜瓜、葫蘆和南瓜葉片進(jìn)行再接種，觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)病初期葉片產(chǎn)生白色近圓形的小粉斑，后逐漸擴(kuò)大成連片白粉斑，形似撒上一層白粉狀物，即病原菌的菌絲體、分生孢子梗和分生孢子.嚴(yán)重時(shí)，白粉布滿整個(gè)葉片，隨后白色粉狀物漸變?yōu)榛野咨蚧液稚▓D2）.病狀的發(fā)展與自然發(fā)病病斑形態(tài)相同，而對照組未產(chǎn)生任何癥狀.取接種后產(chǎn)生的病斑進(jìn)行顯微觀察，結(jié)果表明與接種病菌相同，證實(shí)原接種菌為白粉病菌.

圖2 瓜類白粉病菌的癥狀特征Fig.2 The symptom characteristics of cucurbits powdery mildew pathogen

3.3 白粉病菌DNA 的提取

利用改良的真菌DNA 提取方法提取瓜類白粉病菌的DNA，經(jīng)分光光度計(jì)檢測總DNA 的質(zhì)量，A260／280比值均在1.8左右，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示有兩條帶，且條帶中間有拖尾現(xiàn)象，表明所提取的真菌DNA 有部分降解，理論上可作為模板用于PCR 擴(kuò)增（圖3）.

圖3 瓜類白粉病菌總基因組DNA 的電泳圖Fig.3 Electrophoretic gel image of genomic DNA from cucurbits powdery mildew pathogen

3.4 ITS序列的擴(kuò)增及分析

本研究采用真菌核糖體ITS區(qū)通用引物ITS1和ITS4為引物，分別以黃瓜、甜瓜、葫蘆、南瓜白粉病菌DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增瓜類白粉病菌核糖體基因的ITS區(qū)，經(jīng)35個(gè)循環(huán)后得到500bp左右的目的片段（圖4）.

圖4 瓜類白粉病菌的ITS擴(kuò)增電泳圖Fig.4 Electrophoretic gel image of amplified ITS products in cucurbits powdery mildew pathogen

經(jīng)過PCR 產(chǎn)物測序得到黃瓜、葫蘆、甜瓜、南瓜白粉病菌ITS序列，大小分別為558bp、561bp、563bp、514bp（圖5），并做出4種瓜類白粉病菌的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）.將序列上傳至NCBI中的Genbank數(shù)據(jù)庫，得到了4種瓜類白粉病菌ITS序列的登錄號，與其他同源序列比對后對其進(jìn)行分析（表2）.

圖5 4種瓜類白粉病菌的ITS核苷酸序列同源性比較Fig.5 Sequence alignment of the four cucurbits powdery mildew ITS regions

圖6 4種瓜類白粉病菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 The phylogenetic tree of cucurbits powdery mildew

3.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

圖7 根據(jù)ITS序列構(gòu)建的瓜類白粉病菌系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Neighbor－joining consensus tree of cucurbits powdery mildew pathogen based on ITS sequence data

將4 種瓜類白粉病菌ITS 序列在NCBI的Blast數(shù)據(jù)庫上比對，搜索同源性較高的序列，聚類分析后發(fā)現(xiàn)這些序列明顯分為兩個(gè)亞支，周口地區(qū)的黃瓜、甜瓜、葫蘆、南瓜白粉病聚在一個(gè)進(jìn)化亞支上，說明4種白粉病菌具有很高的親緣關(guān)系，并且它們與日本美女櫻白粉病菌（登錄號為AB046985）、英國水母柱樹白粉病菌（登錄號為GQ390796）同源性均高達(dá)100%，同時(shí)又與中國商丘豆角白粉病菌（登錄號為GQ927253）、中國哈爾濱甜瓜白粉病菌（登錄號為EU294368）、美洲南瓜白粉病菌（登錄號為AF011321）、澳大利亞豇豆白粉病菌（登錄號為AY450961）、日本櫓豆白粉病菌（登錄號為AB040305）親緣關(guān)系較近，序列保守性較強(qiáng)，聚在同一亞支上.

4 討論與分析

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，近幾年來白粉病在國內(nèi)外發(fā)病范圍不斷擴(kuò)大，不僅在瓜類上發(fā)現(xiàn)白粉病菌，在其他蔬菜類（番茄［10］）、糧食作物（小麥［11］）和景觀植物（大葉黃楊［12］、月季［13］）上也有白粉病的發(fā)生.

本研究首先對周口地區(qū)黃瓜、甜瓜、葫蘆和南瓜白粉病菌進(jìn)行顯微形態(tài)學(xué)觀察分析，通過對其分生孢子形狀及著生方式，纖維狀體的有無，初級芽管萌發(fā)方式的觀察，初步認(rèn)定4種瓜類白粉病菌屬于單囊殼白粉病菌S.fuliginea.

在觀察白粉病菌時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)一些與文獻(xiàn)描述有所差異的現(xiàn)象，第一，有文獻(xiàn)［14］描述纖維狀體的形狀為盤狀和新月形，而本研究發(fā)現(xiàn)還有棒狀的纖維狀體（圖1，C），推測可能是由于顯微鏡鏡深的不同引起這種差異.第二，觀察發(fā)現(xiàn)分生孢子梗上的分生孢子數(shù)目一般為4～12個(gè)，而一些文獻(xiàn)［11］所提到的分生孢子梗上僅有1～3個(gè)分生孢子，可能是由地域差異造成的.第三，S.fuliginea分生孢子的初級芽管從分生孢子側(cè)面萌發(fā)長出，而筆者卻觀察到黃瓜白粉病菌有從側(cè)面和頂端萌發(fā)的現(xiàn)象（圖1，E），具體原因還有待進(jìn)一步研究.第四，黃瓜、甜瓜、南瓜白粉病菌的子囊果形態(tài)為常見的扁球形，而葫蘆白粉病菌子囊果為罕見的長梭形（圖1，F(xiàn)），推斷可能與其小種間進(jìn)化有關(guān).

目前國內(nèi)外對主要利用28SrDNA 和ITS rDNA序列對瓜類白粉病菌進(jìn)行分子鑒定［15］，本研究通過對河南周口市的4種瓜類白粉病菌的ITS序列及進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，其一，哈爾濱甜瓜白粉病菌、美洲南瓜白粉病菌、商丘豆角白粉病菌、澳大利亞豇豆白粉病菌、日本黑豆白粉病菌與周口地區(qū)4種瓜類白粉病菌均聚在一支.另外，本實(shí)驗(yàn)室也對豆類白粉病菌進(jìn)行了研究，比對發(fā)現(xiàn)：周口地區(qū)的瓜類白粉病菌和豆類白粉病菌同源性超過97%（未發(fā)表），由此推測瓜類白粉病與豆類白粉病在進(jìn)化上差異極小，保守性很強(qiáng).其二，周口甜瓜白粉病菌與哈爾濱甜瓜白粉病菌同源性為93%，說明瓜類白粉病菌的進(jìn)化跟地域的遠(yuǎn)近有一定的關(guān)系，地域的差異導(dǎo)致了小種進(jìn)化出現(xiàn)一定的變異.其三，4種瓜類白粉病菌與日本美女櫻白粉病菌和英國水母柱樹白粉病菌同源性均高達(dá)100%，而美女櫻是一年生的草本花卉，水母柱樹是一種常綠小喬木，3種宿主之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但是白粉病菌同源性卻極高，說明該白粉病菌的進(jìn)化較慢，不同宿主間的白粉病菌差異較小.

由于傳統(tǒng)的瓜類白粉病的防治主要依靠農(nóng)藥等殺菌劑，對環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染，因此，學(xué)者開始對生防菌和植物源農(nóng)藥進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在黃瓜葉片噴施一定濃度的硅酸鹽、碳酸鹽、磷酸鹽或橄欖油能均有效抑制黃瓜白粉病菌的發(fā)生，減少了傳統(tǒng)農(nóng)藥防治對環(huán)境的污染，并減少由此帶來的經(jīng)濟(jì)上的花費(fèi)［16－17］；另外，有學(xué)者［18］發(fā)現(xiàn)用低聚殼聚糖處理感染白粉病菌的黃瓜葉片也可顯著減少白粉病菌的發(fā)展.除此之外，著重加強(qiáng)分子生物技術(shù)和細(xì)胞生物技術(shù)在瓜類白粉病抗性育種工作中的應(yīng)用，以及抗白粉病分子機(jī)制的研究，可加快瓜類白粉病抗病育種工作的進(jìn)程.國外對瓜類白粉病菌的鑒定工作起步較早，在對甜瓜白粉病菌生理小種鑒定方面的研究，日本一直處于領(lǐng)先水平，他們對小種的種類、致病性以及分布都做了全面細(xì)致的研究［19－20］，而且已經(jīng)選育出了許多抗白粉病菌小種的品種.

本研究通過對無性孢子纖維狀、芽管萌發(fā)方式及子囊果和子囊孢子的觀察，明確了河南省周口地區(qū)瓜類白粉病的病原菌為S.fuliginea，為河南省瓜類白粉病菌生理小種、抗性遺傳的研究奠定了基礎(chǔ).

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