朱鵬錦，楊 莉，師生波，韓 發(fā)

（1.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530000；2.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008）

1 引言

美麗風(fēng)毛菊（Saussureapulchra）為多年生草本植物，主要分布于青海、西藏和甘肅等部分地區(qū)，生長在海拔1900～4600m的山坡草地、灘地、高寒草甸，是典型的高山植物[1]。其根可入藥，味苦、辛，性寒，有清熱解毒功效，主治流行感冒、麻疹和風(fēng)疹，為青藏高原地區(qū)常見的一種藥用植物[2]。青藏高原由于海拔較高，形成了寒冷、干燥、太陽總輻射高和近地面紫外線強的獨特生態(tài)環(huán)境，被稱為“世界第三極”，隨著海拔的增加，影響植物生長發(fā)育的生態(tài)環(huán)境隨之發(fā)生顯著的變化[3]。因此，在高原氣候的寒冷、干燥、太陽總輻射高和強紫外輻射等環(huán)境因子的綜合作用下，高山植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生長發(fā)育受到很大的限制，迫使其不斷對極端環(huán)境產(chǎn)生的脅迫做出生理生化方面的響應(yīng)以增強適應(yīng)性。有許多文獻報道，低溫、強紫外輻射等逆境脅迫均可造成植物體內(nèi)的代謝紊亂，破壞自由基動態(tài)平衡以致細胞、組織受到損傷[4，5]。但有研究表明，植物體內(nèi)的適應(yīng)機制可以有效清除活性氧自由基起到減緩或者保護的作用，且抗氧化物的活力和含量與植物抗逆能力強弱有密切聯(lián)系[6，7]。盡管關(guān)于逆境脅迫對植物的生長發(fā)育、形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化等方面的影響的研究有很多，但自然條件下以青藏高原為實驗平臺，研究高山植物的生理生化機制對高原氣候脅迫的研究報道較少。所以，本研究以美麗風(fēng)毛菊為材料探究不同海拔下高山植物的生理生化變化規(guī)律及其特征，旨在揭示高山植物適應(yīng)青藏高原極端環(huán)境脅迫的抗逆機理，為篩選優(yōu)良的抗逆種質(zhì)資源及保護脆弱的高寒生態(tài)系統(tǒng)均具有重要而深遠的意義。

2 材料與方法

2.1 采樣地點及氣候概況

美麗風(fēng)毛菊分別采自青藏高原的2個不同海拔地區(qū)，其中西寧位于青藏高原東部邊緣（N36°37′，E101°46′），海拔2200m，年均溫為5.8℃，最冷月均溫為－8.1℃，7月份月均溫為20.0℃，年總輻射為612.5MJ·m－2，7月份降水量79.8mm，屬高原大陸性半干旱氣候；中國科學(xué)院海北高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)定位站（海北）位于青藏高原的東北部，即祁連山東段的冷龍嶺南麓（N37°37′，E101°19′），山地平均海拔4000m，受到明顯的高原大陸性氣候影響，無四季之分，僅有冷暖季之別，年平均氣溫－1.7℃，年平均降水量為590.1mm，降水主要集中在5～9月（占全年降水總量的80%）。年均實際日照時間為2462.7h，占理論可照時間的55.0%，年平均太陽輻射6170MJ·m－2，占太陽總輻射的60.1%。

2.2 光合色素含量的測定

選取健康無傷斑的葉片，避開主脈用打孔器（直徑0.7cm）取18個葉圓片，混合均勻隨機分成3組每組6片，將葉圓片分別放入裝有10mL葉綠素提取液（V丙酮：V乙醇：V水＝45∶45∶10）的試瓶中，密封瓶蓋，密封低溫保存至葉圓片無色約10d。用紫外分光光度計（UV－1601，日本）檢測在663nm、645nm、440nm波長處的吸光值。葉綠素含量的測定與計算參照Arnon的方法[8]，類胡蘿卜素含量的測定與計算參照朱廣廉的測定方法[9]，光合色素以單位葉片重量的含量表示。

2.3 紫外吸收物質(zhì)的測定

選葉片方法與光合色素含量測定的一樣，取葉圓片混勻后隨機分成3組每組6片置于10mL紫外吸收物質(zhì)提取液（V甲醇：V鹽酸：V水＝79∶1∶20）的試瓶中，蓋緊密封、避光低溫保存10d至葉圓片無色。用UV－1601紫外分光光度計測量200～400nm吸收值，葉片的紫外吸收物質(zhì)含量計算參照Caldwell[10]，以 A／cm2表示。

2.4 抗氧化酶活性的測定

稱取0.5g無病蟲害的剪碎的葉組織加入5mL，62.5mmol／L pH 值7.8PBS（含0.3%PVP）和少量石英砂，在冰浴中勻漿，然后15000g，4℃低溫離心10min，取上清液4℃低溫保存。超氧化物歧化酶（SOD）按Giannopolitis C N等的方法測定[11]，以抑制氮藍四唑（NBT）光化還原，50%作為1個酶單位，酶活性以U／g；過氧化物酶（POD）按 Omran R G 等的方法測定[12]，以（A470）每分鐘OD值降低0.01為1個酶單位，酶活性以U／g表示；過氧化氫酶（CAT）按Chacne B等的方法測定[13]，以每分鐘OD值降低（A240的降低）來相對定量過氧化氫酶的酶活性，0.01為1個酶單位，酶活性以U／g表示。

2.5 丙二醛含量的測定

按照Raeri的方法進行測定[14]，用UV－1601紫外分光光度計測量上清液450nm，532nm和600nm吸收值，具體計算如下：

MDA濃度（μmol／L）＝6.45×（OD532－OD600）－0.56×OD450

式中VT 為酶提取液體積（mL）；W 為樣品鮮重（g）。

2.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析并選用LSD進行顯著性檢驗。數(shù)據(jù)為5次以上重復(fù)的平均值，不同小寫字母表示顯著差異性（p＜0.05）。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同海拔美麗風(fēng)毛菊葉片光合色素含量的變化

在植物光合作用過程中，葉片的光合色素涉及光能的吸收、能量傳遞和轉(zhuǎn)化，是客觀反映其利用光能的重要指標(biāo)，也是作為判斷植物光合生理能力、反映環(huán)境脅迫狀況的重要指標(biāo)[15，16]。本實驗發(fā)現(xiàn)生長于不同海拔的美麗風(fēng)毛菊葉片中的光合色素含量有著明顯差別（表1）。隨著海拔的升高，Chla和Chlb均呈現(xiàn)出下降的趨勢，而Car、Chla／Chlb和Car／Chla＋b的比值則呈現(xiàn)出增加的趨勢，這可能與海北地區(qū)海拔較高且氣候寒冷多變有關(guān)。葉綠素含量的下降，可能有利于減少葉片對光的吸收，使植物免受強輻射的損傷；類胡蘿卜素的增加可以對強近地面UV－B輻射和高太陽輻射的脅迫起到促進過剩光能耗散的作用，避免強光對光合機構(gòu)破壞。

表1 不同海拔美麗風(fēng)毛菊葉片光合色素含量的變化

3.2 不同海拔美麗風(fēng)毛菊抗氧化酶活性的比較

植物在受到逆境脅迫時，其生理生化代謝發(fā)生紊亂以致產(chǎn)生多種自由基，而體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶（SOD）可將超氧陰離子O－2歧化為 H2O2和O2；過氧化物酶（POD）能將H2O2和有機的氫過氧化物等底物轉(zhuǎn)變成無毒性物質(zhì)；過氧化氫酶（CAT）再把H2O2催化生成H2O從而減少體內(nèi)自由基[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著海拔的升高美麗風(fēng)毛菊的抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性也出現(xiàn)增強的趨勢，其中生長在海北地區(qū)的美麗風(fēng)毛菊體內(nèi)超氧化酶歧化酶（SOD）活性比生長在西寧地區(qū)的高且具有顯著性差異（表2）。

表2 不同海拔美麗風(fēng)毛菊抗氧化酶活性的比較

3.3 不同海拔美麗風(fēng)毛菊葉片紫外吸收物質(zhì)和丙二醛含量的比較

植物體內(nèi)的丙二醛（MDA）是細胞中活性氧代謝失衡，導(dǎo)致產(chǎn)生過量的自由基作用于生物膜的多不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量的多少可以反映逆境對其膜受到損傷程度的大小[18]。本研究結(jié)果表明，美麗風(fēng)毛菊葉中膜脂過氧化產(chǎn)物的含量隨海拔升高呈增加趨勢，其中生長在海北地區(qū)的葉片MDA含量較高，但兩地差異不顯著。還有植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物（黃酮類和酚醛類等化合物）對青藏高原地區(qū)強近地面UV－B輻射和高太陽輻射具有明顯的吸收作用，這種生理生化特性是植物響應(yīng)環(huán)境和自我保護的機制。在研究中，也發(fā)現(xiàn)不同海拔的美麗風(fēng)毛菊葉片的紫外吸收物質(zhì)含量存在差異并且隨著海拔的升高而增加，但無顯著性（表3）。

表3 不同海拔美麗風(fēng)毛菊葉片丙二醛和紫外吸收物質(zhì)含量的比較

4 討論

青藏高原海拔較高，空氣稀薄以及上空臭氧總量低于同緯度的地區(qū)，導(dǎo)致到達近地面的UV－B輻射增加，形成了獨特的生態(tài)環(huán)境，是研究植物對極端環(huán)境的響應(yīng)和適應(yīng)性的理想實驗平臺[19]。在極端環(huán)境的各種脅迫因子相互“耦聯(lián)”作用下，植物不僅通過改變?nèi)~片形態(tài)、調(diào)整葉片角度、增加葉表蠟質(zhì)層和微絨毛反射部分太陽輻射而有效避免強光和紫外線造成的損傷，還從生理生化過程中作出一系列的調(diào)整以適應(yīng)寒冷和干旱的脅迫，尤其是植物體內(nèi)的一些次生代謝產(chǎn)物和抗氧化酶系統(tǒng)，能清除活性氧自由基，維持細胞中活性氧代謝的平衡[20～22]。但在青藏高原地區(qū)低溫和強輻射等環(huán)境因子脅迫均能引起植物生理代謝的失衡，活性氧自由基含量積累，導(dǎo)致膜系統(tǒng)、蛋白質(zhì)和核酸等大分子的破壞，以致植物的生長發(fā)育和生殖繁衍產(chǎn)生深遠的負面影響[23～25]。然而，高山植物雖然生長于惡劣的環(huán)境條件下，但其光合作用等生命過程并未明顯減弱，而呈現(xiàn)出很強的適應(yīng)性，這可能與其體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)的保護有很大關(guān)系[26，27]。

美麗風(fēng)毛菊在青藏高原一定海拔范圍內(nèi)出現(xiàn)垂直分布，是一種多年生的高山植物。本研究結(jié)果不僅發(fā)現(xiàn)，隨著海拔的升高，美麗風(fēng)毛菊葉片中的膜脂過氧化而產(chǎn)生的MDA含量升高，楊景宏等研究紫外線－B輻射對作物小麥葉綠體膜組分和膜流動性的影響，發(fā)現(xiàn)UV－B輻射誘導(dǎo)小麥葉片中MDA含量升高是膜脂發(fā)生過氧化導(dǎo)致葉綠體膜系統(tǒng)受破壞造成的；羅麗瓊等[28]以云南報春花為材料研究了在不同海拔地區(qū)UV－B輻射對其葉片中丙二醛、蛋白質(zhì)含量的影響也得出了相似的結(jié)果，這說明隨著高海拔升高近地面UV－B輻射增強植物受到脅迫致使質(zhì)膜發(fā)生過氧化損傷更為嚴重。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，隨著海拔的升高美麗風(fēng)毛菊葉片中的葉綠素含量出現(xiàn)降低的趨勢而構(gòu)成比例卻相反，葉綠素含量的降低可能是減少光能的吸收防止因光能過剩而發(fā)生光破壞現(xiàn)象，Car含量增加和Car／Chl比值升高可以促進非光化學(xué)猝滅耗散過剩光能起到光破壞防御的功能，這些變化可能是植物光合生理對青藏高原地區(qū)高太陽輻射、強紫外線等獨特環(huán)境的響應(yīng)和自我保護的機制。

張紅霞等以蠶豆為研料研究不同強度UV－B輻射對蠶豆幼苗生長發(fā)育的影響，結(jié)果表明UV－B輻射降低葉綠素a、b及總?cè)~綠素含量[29]。且我們的研究還發(fā)現(xiàn)美麗風(fēng)毛菊的SOD、POD和CAT活性也隨著海拔的升高而增加，其中兩個不同海拔地區(qū)相比，海北地區(qū)的美麗風(fēng)毛菊的SOD活性較高且具有顯著差異。通常認為SOD是細胞抗氧化脅迫的關(guān)鍵酶，其活性的升高有利于低溫、強UV－B輻射等逆境因子脅迫產(chǎn)生的O2等活性氧自由基的清除，與此同時的葉片中POD和CAT活性也升高，有利于細胞中進一步對H2O2的清除。李惠梅等以不同海拔的麻花艽為材料研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象[29]。此外，美麗風(fēng)毛菊葉片中的紫外吸收物質(zhì)含量也隨著海拔的升高而呈現(xiàn)增加的趨勢。有許多研究結(jié)果證明，植物葉片表皮細胞含有一些類黃酮和酚醛類化合物能大量吸收UV－B輻射改變穿透率起到保護作用[30]。有諸多學(xué)者認為植物受到UVB輻射后體內(nèi)類黃酮明顯增加，且這些類黃酮化合物在紫外線的波長范圍內(nèi)具有吸收作用，從而可減少UVB輻射對核酸、蛋白質(zhì)等大分子的破壞作用，形成保護自我保護機制，如葉蠟中的黃酮類化合物為游離狀態(tài)，表現(xiàn)為O－甲基化和親脂性等特性，這使化合物紫外吸收特性偏向更短的波長范圍，以至于在230～320nm處具有明顯的特異吸收短波長紫外線的能力，從而保護植物葉片免遭紫外線傷害[31]；還有類黃酮可以直接清除自由基（羥自由基、氧自由基），如植物體內(nèi)4－羥基黃酮等轉(zhuǎn)變成保護性黃酮清除氧化自由基。

5 結(jié)語

隨著海拔升高極端環(huán)境脅迫壓力增加，美麗風(fēng)毛菊從生理生化方面做出了適應(yīng)性響應(yīng)，首先通過增加葉片表皮細胞中的紫外吸收物質(zhì)含量濾除UV－B輻射以減少機體損傷，同時抗氧化酶系統(tǒng)之間可能存在一定的協(xié)同關(guān)系通過增強抗氧化酶活性清除低溫、強近地面UV－B輻射等脅迫產(chǎn)生的自由基以維持機體代謝的平衡，這種協(xié)同作用可能是美麗風(fēng)毛菊適應(yīng)高山環(huán)境脅迫的重要生理機制之一。

[1]劉尚武.青海植物志[R].西寧：青海人民出版社，1999.

[2]劉永昌，劉海青.青海省風(fēng)毛菊屬藥用植物資源的初步調(diào)查[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，2001，52（1）：289～289.

[3]潘紅麗.海拔梯度上的植物生長與生理生態(tài)特性[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報，2009，18（2）：722～730.

[4]巫光宏.低溫脅迫對馬占相思樹代謝的影響研究[J].林業(yè)科學(xué)研究，2001，14（6）：633～640.

[5]朱鵬錦.植物對UV－B輻射脅迫響應(yīng)的研究進展[J].熱帶生物學(xué)報，2011，2（1）：89～96.

[6]江福英，李 延，翁伯琦.植物低溫脅迫及其抗性生理[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2002，17（3）：190～195.

[7]王海霞.植物對增強UV－B輻射的防御機制研究進展[J].西北植物學(xué)報，2007，27（7）：1491～1497.

[8]Arnon D I.Copper enzymes in isolated chloroplasts[J].Polyphenoloxidase in Beta vulgaris.Plant Physiology，1949，24（1）：126～138.

[9]朱廣廉.植物生理實驗[M].北京：北京大學(xué)出版社，1990.

[10]Caldwell M M，Solar ultraviolet radiation as an ecological factor for alpine plants[J].Ecological Monographs，1968，38（3）：243～268.

[11]Giannopolitis C N and S K Ries.Superoxide Dismutases：II.Purification and Quantitative Relationship with Water－soluble Protein in Seedlings[J].Plant Physiology，1977，59（2）：315～318.

[12]Omran R G，Peroxide levels and the activities of catalase，peroxidase，and indoleacetic acid oxidase during and after chilling cucumber seedlings[J].Plant physiology，1980，65（2）：407～408.

[13]Chance B and A Maehly，Assay of catalases and peroxidases[J].Methods in enzymology，1955（2）：764～775.

[14]Ranieri Glutathione－ascorbic acid cycle in pumpkin plants grown under polluted air in open－top chambers[J].Journal of plant physiology，1993，142（3）：286～290.

[15]Matsubara S，Lutein epoxide cycle，light harvesting and photoprotection in species of the tropical tree genus Inga.Plant[J].Cell ＆ Environment，2008，31（4）：548～561.

[16]張守仁.葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)的意義及討論[J].植物學(xué)通報，1999，16（4）：444～448.

[17]Yannarelli G G.Heme oxygenase up－regulation in ultraviolet－B irradiated soybean plants involves reactive oxygen species[J].Planta，2006，224（5）：1154～1162.

[18]Treutter D，Significance of flavonoids in plant resistance and enhancement of their biosynthesis[J].Plant Biology，2005，7（6）：581～591.

[19]莫申國.青藏高原的主要環(huán)境效應(yīng)[J].地理科學(xué)進展，2004，23（2）：88～96.

[20]戴怡齡.寒區(qū)不同海拔橘黃罌粟葉片結(jié)構(gòu)特征的比較研究[J].西北植物學(xué)報，2004，24（3）：495～503.

[21]梁 濱，周 青.UV－B輻射對植物類黃酮影響的研究進展[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007（3）：191～194.

[22]左園園.短期增強UV－B輻射對青榨槭幼苗生理特性的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2005（9）：1682～1686.

[23]陳 拓，安黎哲.UV－B輻射對蠶豆葉膜脂過氧化的影響及其機制[J].生態(tài)學(xué)報，2001，21（4）：579～583.

[24]馮國寧.增強UVB輻射對菜豆蛋白質(zhì)代謝的影響[J].植物學(xué)報，1999（8）：833～836.

[25]強維亞.增強UV－B輻射對大豆胚軸DNA損傷、修復(fù)和蛋白質(zhì)含量的影響[J].生態(tài)學(xué)報，2004（4）：852～856.

[26]姚曉芹，劉 慶.陸生植物體內(nèi)酶系統(tǒng)對UV－B輻射增強的響應(yīng)[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2006（5）：939～942.

[27]董新純.增強UV－B條件下類黃酮與苦蕎逆境傷害和抗氧化酶的關(guān)系[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2006（2）：157～162.

[28]羅麗瓊.低緯高原地區(qū)UV－B輻射對報春花丙二醛、蛋白質(zhì)含量的影響[J].廣西植物，2008（1）：130～135.

[29]張紅霞，吳能表，洪 鴻.不同強度的UV－B輻射對蠶豆種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J].西南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008（8）：132～136.

[30]李惠梅，師生波.增強UV－B輻射對麻花艽葉片的抗氧化酶的影響[J].西北植物學(xué)報，2005（3）：519～524.

[31]李 鵬.抗UV－B輻射植物黃酮類化合物研究進展[J].生態(tài)學(xué)雜志，2001（6）：36～40.

[32]林植芳.亞熱帶植物葉片UV－B吸收化合物的積累[J].生態(tài)學(xué)報，1998（1）：90～95.