胡 堅(jiān),楊閏平,李恒進(jìn),趙 華
解放軍總醫(yī)院 皮膚科,北京 100853
急性光損傷是皮膚對(duì)日光中中波紫外線(ultraviolet B,UVB)產(chǎn)生的一種急性炎癥反應(yīng),正常皮膚在單次過度照射UVB后即可引起這種局部炎癥反應(yīng)。急性光損傷的機(jī)制及防治一直是人們普遍關(guān)注的問題,研究認(rèn)為多種細(xì)胞因子參與了其發(fā)病過程。凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)屬于死亡結(jié)構(gòu)域超家族成員,由N端的熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrindomain,PYD)和C端的caspase募集結(jié)構(gòu)域(caspase activation and recruitment domain,CARD)構(gòu)成,在肺、肝、結(jié)腸、卵巢、皮膚、眼、白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等組織和細(xì)胞表達(dá),在先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)趨化因子的活性、淋巴細(xì)胞的趨化性、抗原的攝取和呈遞等方面具有一定的意義[1-2],而半胱氨酸蛋白酶caspase-1作為ASC的一種常見下游因子參與了ASC引起的多種生理及病理過程[3]。Watanabe和Feldmeyer等發(fā)現(xiàn)ASC和caspase-1在UVB照射后的人角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng),提示ASC和caspase-1可能參與了UVB所致急性光損傷的發(fā)病過程[4-5]。因此本實(shí)驗(yàn)通過觀察ASC和caspase-1在UVB誘導(dǎo)的急性光損傷皮損中的表達(dá),探討其在急性光損傷發(fā)病中的可能機(jī)制。
1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠共30只,6~8周齡,體質(zhì)量18~20 g。小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證編號(hào):SCXK(京)2011-0004),飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
2 試劑和儀器 小鼠ASC、caspase-1單克隆抗體,Abcam公司;UVB燈管(TL20W/12RS), PHLIPS公司。
3 小鼠急性光損傷模型的建立 輻照計(jì)測(cè)定UVB燈管波長(zhǎng)為280~320 nm,距離燈管20 cm處輻照強(qiáng)度為0.33 mW/cm2。固定照射距離為20 cm,根據(jù)輻射時(shí)間(s)=所需照射劑量(mJ/cm2)/輻照強(qiáng)度(mW/cm2)確定輻照時(shí)間。預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定MED:將10只小鼠分為5組,每組2只,參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)[6-7],分別對(duì)耳部照射30、90、150、300、600 mJ/cm2劑量的UVB,測(cè)得MED約為90 mJ/cm2。觀察不同劑量UVB照射小鼠耳部臨床和組織病理表現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組鼠耳采用4倍MED即360 mJ/cm2劑量給予單次照射,表現(xiàn)與急性光損傷的表現(xiàn)一致[8-9]。實(shí)驗(yàn)組操作如下:預(yù)熱UVB燈管5 min,將小鼠固定于工作臺(tái)上。小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,每組10只,對(duì)照組不照射UVB,實(shí)驗(yàn)組照射4倍MED劑量UVB。觀察實(shí)驗(yàn)組的光損傷變化,于照射后24 h取小鼠耳。
4 免疫組化檢測(cè)皮膚ASC和caspase-1 分別取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠耳, 4%甲醛固定,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。采用Elivision法,2 μm厚度連續(xù)切片,高壓鍋加熱修復(fù),雙氧水消除過氧化酶。分別滴加1∶100 ASC和1∶100 caspase-1一抗,4 ℃濕盒過夜后PBS洗3次,每次3 min,滴加二抗,室溫靜置20 min后PBS洗3次,再加三抗,靜置20 min,PBS洗3次。DAB顯色,蘇木精復(fù)染,脫水、透明、中性樹膠封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。
5 結(jié)果判定 由兩名醫(yī)生對(duì)免疫組化染色切片進(jìn)行評(píng)估。在顯微鏡下觀察表皮細(xì)胞著色情況,每張陽(yáng)性切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400),各計(jì)數(shù)100個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比,根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例,無(wú)陽(yáng)性染色為0分、0~25%為1分、26%~50%為2分、51%~75%為3分、≥76%為4分;并按染色強(qiáng)度無(wú)、弱、中、強(qiáng)分別計(jì)為0~3分。綜合兩個(gè)指標(biāo)將評(píng)分分為4級(jí),0分為陰性、1~3分為弱陽(yáng)性、4~5分為陽(yáng)性、6~7分為強(qiáng)陽(yáng)性。
6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件,兩獨(dú)立樣本非正態(tài)分布定量資料采用Wilconxon秩和檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖1 左側(cè)為對(duì)照組小鼠,右側(cè)為實(shí)驗(yàn)組小鼠Fig.1 Mice in the blank control group (left)and experimental group (right)
圖2 小鼠急性光損傷模型(HE×100) 對(duì)照組(左);實(shí)驗(yàn)組(右)Fig.2 UVB-induced light injury model in blank control group (left)and experimental group (right)(HE×100)
圖3 ASC在小鼠耳部皮膚的表達(dá) 對(duì)照組(左);實(shí)驗(yàn)組(右)Fig.3 Immunohistochemical staining showing expressions of ASC-like protein in blank control group (left) and experimental group (right)
圖4 caspase-1在小鼠耳部皮膚的表達(dá) 對(duì)照組(左);實(shí)驗(yàn)組(右)Fig.4 Immunohistochemical staining showing expressions of caspase-1 in blank control group(left) and experimental group (right)
1 小鼠皮膚急性光損傷模型 與對(duì)照組相比,4倍MED劑量UVB照射的實(shí)驗(yàn)組小鼠24 h后耳部皮膚水腫、增厚,出現(xiàn)紅斑、毛細(xì)血管擴(kuò)張。見圖1。組織病理改變,HE染色顯示表皮細(xì)胞增生、水腫、部分細(xì)胞空泡形成、核固縮,真皮乳頭淺層水腫、血管擴(kuò)張、管周淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖2。臨床表現(xiàn)和組織病理均符合急性光損傷表現(xiàn)。
2 免疫組化結(jié)果 1)ASC在小鼠耳部表皮的表達(dá):對(duì)照組小鼠耳部表皮部分細(xì)胞胞漿和胞核染為淺棕黃色,染色評(píng)分中位數(shù)為1.23;照射4倍MED的實(shí)驗(yàn)組鼠耳部表皮細(xì)胞水腫,排列紊亂,表皮全層細(xì)胞胞漿和胞核染為深棕黃色,ASC表達(dá)增強(qiáng),染色評(píng)分中位數(shù)為4.11,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=65.0,P< 0.01)。見圖 3。2)caspase-1在小鼠耳部表皮的表達(dá):對(duì)照組小鼠耳部表皮部分細(xì)胞胞漿和胞核染為淺棕黃色,染色評(píng)分中位數(shù)為1.16;照射4倍MED的實(shí)驗(yàn)組鼠耳部表皮細(xì)胞水腫,排列紊亂,染為棕黃色,且陽(yáng)性染色細(xì)胞增多,caspase-1表達(dá)增強(qiáng),染色評(píng)分中位數(shù)為1.59,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=56.5,P<0.01)。見圖4。
國(guó)內(nèi)外雖不乏關(guān)于急性光損傷的研究,但目前尚未形成統(tǒng)一的動(dòng)物模型,不同模型的差異主要表現(xiàn)在:1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:國(guó)外最多采用SKH-1無(wú)毛小鼠,其優(yōu)點(diǎn)在于皮膚裸露便于照射,且具有胸腺,免疫功能正常[6]。而國(guó)內(nèi)多采用Balb/C小鼠剃毛后照射UVB[7]。2)照射部位:因小鼠背部體表面積較大,實(shí)驗(yàn)多對(duì)背部進(jìn)行照射。3)光源:采用日光模擬器或紫外熒光燈,UVB波長(zhǎng)約為290~320 nm。4)UVB照射方法:國(guó)外SKH-1小鼠多采用UVB單次照射,劑量為 200、360、800 mJ/cm2不等[6];Sumiyoshi等對(duì)C57BL/6J小鼠進(jìn)行UVB 120 mJ/cm2(約為3.3MED)照射[8]。而國(guó)內(nèi)多對(duì)Balb/C小鼠進(jìn)行180 mJ/cm2單次或多次照射[7]。5)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn):以臨床表現(xiàn)為紅斑、水腫;組織病理表現(xiàn)為表皮細(xì)胞水腫、空泡形成、核固縮,表皮內(nèi)或表皮下水皰形成,真皮血管擴(kuò)張等為急性光損傷特征[6,8]。本實(shí)驗(yàn)采用UVB單次照射Balb/C小鼠,選取毛發(fā)較少的耳部皮膚,借鑒國(guó)內(nèi)外經(jīng)驗(yàn),并根據(jù)測(cè)定的MED以及觀察劑量的小鼠耳部紅斑反應(yīng),確定采用4倍MED劑量,臨床及組織病理表現(xiàn)與急性光損傷基本符合,認(rèn)為造模成功。
以往研究認(rèn)為,UVB引起的急性光損傷主要表現(xiàn)為急性炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡兩個(gè)方面。1)急性炎癥反應(yīng):UVB照射后誘導(dǎo)生成的ROS作為第二信使通過p38MAPK、ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活轉(zhuǎn)錄因子c-Jun、c-Fos、NF-kB,誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞生成前炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α,促進(jìn)角質(zhì)形成、細(xì)胞增殖及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的浸潤(rùn);UVB還可激活環(huán)氧合酶COX-2,進(jìn)一步誘導(dǎo)合成PGE2、VEGF、MMPs、ICAM-1、PECAM-1等,促進(jìn)炎癥反應(yīng)及血管生成。2)細(xì)胞凋亡:DNA可直接吸收UVB,在相鄰嘧啶堿基之間形成二聚體光產(chǎn)物。此外,UVB誘導(dǎo)生成過量的活性氧及氮簇,超過了機(jī)體的清除能力,引起多種形式的DNA損傷如單鏈斷裂、鏈間交聯(lián)、堿基修飾等。
研究顯示,ASC可通過多種途徑發(fā)揮生物學(xué)作用[2-3]:1)參與形成NLRP3炎癥小體以參與炎癥反應(yīng)。2)通過寡聚形成超分子結(jié)構(gòu)即焦亡小體調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡。3)參與細(xì)胞凋亡過程。在UVB引起的急性光損傷中,一方面低劑量UVB誘導(dǎo)產(chǎn)生大量ROS,并使細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高,ROS和Ca2+作為危險(xiǎn)因子促使ASC參與形成NALP3炎癥小體。ASC作為接頭蛋白連接前caspase-1,使caspase-1自分裂、活化,并進(jìn)一步促使前IL-1β和前IL-18裂解成為活性IL-1β和IL-18,誘導(dǎo)其他炎癥細(xì)胞因子如IL-6、趨化因子、黏附分子等的合成,放大局部炎癥反應(yīng)[9]。另一方面,UVB也可能通過ROS增強(qiáng)ASC的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。焦亡是新近發(fā)現(xiàn)的一種新的由caspase-1介導(dǎo)的伴有大量炎癥因子釋放的細(xì)胞程序性死亡方式,ASC寡聚形成超分子功能性復(fù)合體通過caspase-1促使DNA的降解,并可導(dǎo)致細(xì)胞膜的完整性喪失,從而使胞內(nèi)容物釋放,加重炎癥反應(yīng)[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)4倍MED的UVB照射后,實(shí)驗(yàn)組小鼠耳部表皮細(xì)胞ASC和caspase-1表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng),提示ASC和caspase-1參與了小鼠急性光損傷的發(fā)病過程,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
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