何 微，喻 陸，高德祿，張世俊

1南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣州 510515；2解放軍第305醫(yī)院，北京 100017

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一類無過量飲酒史和其他明確肝損因素所致的以肝細(xì)胞大泡性脂變?yōu)橹饕±砀淖兊呐R床綜合征[1]。NAFLD自被發(fā)現(xiàn)至今，其明確的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚?，F(xiàn)得到普遍認(rèn)可的是1998年提出的“二次打擊"學(xué)說[2]。該學(xué)說認(rèn)為胰島素抵抗和脂質(zhì)代謝紊亂形成的單純性脂肪肝是第一次打擊，在此基礎(chǔ)上各種原因所致的氧化應(yīng)激(OS)與脂質(zhì)過氧化(LP)損傷引起的炎癥、壞死甚至纖維化、肝硬化則是第二次打擊。最新研究已證明，在NAFLD的形成過程中，脂肪組織分泌的脂肪因子，如TNF-α在誘導(dǎo)和加重IR有重要作用[3-4]，參與NAFLD的“二次打擊”。脂肪甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)是新近發(fā)現(xiàn)的一種可特異性脂解甘油三酯為甘油二酯的重要脂肪酶。有研究指出，ATGL可表達(dá)于肝臟并通過增強(qiáng)甘油三酯水解活性從而減輕脂肪肝[5]，

有學(xué)者認(rèn)為，其有可能為治療NAFLD提供新的思路。現(xiàn)關(guān)于胰島素抵抗藥物治療NAFLD的報(bào)道較多[6-7]，而降脂藥物較少。辛伐他汀和非諾貝特是臨床上療效肯定的兩種降脂藥。因此，本研究以高脂飼料建立NAFLD大鼠模型，采用該兩種降脂藥物治療大鼠NAFLD，在其過程中觀察血清ATGL酶活性及TNF-α水平的變化以及兩者之間的關(guān)系，從而進(jìn)一步尋求NAFLD的可能發(fā)病機(jī)理及探索新的治療靶點(diǎn)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠78只，7周齡，體質(zhì)量210~230 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明號(hào)：SCXK(京)2009-0007(由北京華阜康提供)。

2 高脂飼料配方 10%糖，10%豬油，73.7%普通飼料。該配方根據(jù)文獻(xiàn)[8]改良，由北京華阜康提供。4 ℃儲(chǔ)存。

3 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 大鼠血清TNF-α(E02T0008)和ATGL測定試劑盒(E02A0893)購自上海藍(lán)基；Beckman DXC 800全自動(dòng)生化儀；日本Olympus DP 72顯微鏡；美國BIO-RAD酶標(biāo)儀(model 450型)。辛伐他汀片(杭州默沙東)；微?；侵Z貝特(法國利博福尼公司)。

4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，分為2組：正常對(duì)照組15只，飼以普通維持飼料(北京華阜康提供)；NAFLD組63只，高脂飼料25 g/d，自由飲水。12周末，禁食12 h內(nèi)眥采血2 ml，檢測血脂。處死正常對(duì)照組大鼠2只和NAFLD組3只，取肝臟病檢證實(shí)造模成功后，將余下的NAFLD組大鼠隨機(jī)分為4組：1)NAFLD對(duì)照組15只；2)辛伐他汀組15只，給予辛伐他汀100 mg/(kg·d)灌胃治療；3)非諾貝特組15只，給予非諾貝特40 mg/(kg·d)灌胃治療；4)飲食組15只，給予等量0.9%氯化鈉注射液；除NAFLD對(duì)照組繼續(xù)飼以高脂飼料，其他3組均改飼普通維持飼料。治療4周后，下腔靜脈取血檢測相關(guān)指標(biāo)并處死，提取肝組織病檢。

5 檢測項(xiàng)目和方法 1)血清FBG、TG、TC、AST、ALT、BUN、Scr在Beckman DXC 800全自動(dòng)生化儀上測定，采用Beckman原裝試劑；2)組織學(xué)病檢：將新鮮肝組織置于10%甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察肝臟脂肪變性和炎癥活動(dòng)情況，每張切片觀察5×200個(gè)視野；3)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)定量檢測大鼠血清中TNF-α和ATGL含量。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSSl3.0軟件統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以表示。多組間的多個(gè)樣本均數(shù)比較采用One-wayANOVA檢驗(yàn)，總體方差齊時(shí)，兩兩組間比較采用LSD法檢驗(yàn)；總體方差不齊時(shí)，多組間的多個(gè)樣本均數(shù)比較采用Kruskal-Wills檢驗(yàn)，兩兩組間比較采用Dunnett's T3法檢驗(yàn)。雙變量相關(guān)關(guān)系分析采用pearson直線相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 體重、肝濕重及肝指數(shù)變化 至16周末，與正常對(duì)照組相比，NAFLD對(duì)照組體重、肝濕重及肝指數(shù)均顯著升高(P＜0.01)；兩藥物組及飲食組肝濕重與肝指數(shù)均顯著低于NAFLD對(duì)照組(P＜0.01)；兩藥物組肝指數(shù)顯著低于飲食組(P＜0.05)，見表1。

表1 16周末各組大鼠體重、肝濕重及肝指數(shù)Tab.1 Body weight, liver wet weight, and liver index in different groups at the end of 16th week(-x±s)

2 血脂血糖及肝腎功水平 16周末，與正常對(duì)照組相比，NAFLD對(duì)照組血清TG、TC、FBG、ALT、AST、BUN、Scr均顯著升高(P＜0.05)；兩藥物組血清TG、TC、ALT、AST及BUN、Scr均顯著低于NAFLD對(duì)照組(P＜0.01)；兩藥物組的肝腎功恢復(fù)情況顯著優(yōu)于飲食組(P＜0.05)，見表2。

3 病理學(xué)改變 至16周末，正常對(duì)照組大鼠肝色鮮紅，邊緣銳利，光鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞系排列清晰(圖1A)；高脂飼料喂養(yǎng)至12周末，NAFLD大鼠肝臟增大，色淺黃，邊緣變鈍切面油膩感，光鏡下肝竇狹窄，肝細(xì)胞氣球樣變，胞漿內(nèi)充滿脂滴，以小泡性脂肪滴為主，伴少量炎細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞壞死(圖1 B1)；16周末，NAFLD大鼠肝臟腫脹明顯，色泛白，質(zhì)脆，光鏡下重度脂肪變，肝小葉結(jié)構(gòu)不顯，肝竇消失，胞漿內(nèi)大量大泡性脂肪滴將胞核推向一邊，有些細(xì)胞膜破損，胞核固縮，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(圖1 B2)；經(jīng)辛伐他汀治療后，大鼠肝臟接近正常，鏡下見少量脂肪變肝細(xì)胞，肝竇可見，無明顯炎細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞壞死(圖1C)；非諾貝特組大鼠肝臟腫脹不顯，局部有淺黃，鏡下見少中量變性肝細(xì)胞，肝竇可見，伴有少量炎細(xì)胞浸潤，偶見壞死肝細(xì)胞(圖1D)；飲食組大鼠肝臟較兩藥物組腫脹，局部淺黃，鏡下可見肝細(xì)胞中度脂肪變，為小泡性脂肪滴，伴少量炎細(xì)胞浸潤和壞死肝細(xì)胞(圖1E)。

4 血清ATGL酶濃度及TNF-α水平 至16周末，與正常對(duì)照組相比，NAFLD對(duì)照組血清ATGL酶濃度顯著降低、TNF-α顯著升高(P＜0.01)；相較于NAFLD對(duì)照組，兩藥物組大鼠血清TNF-α顯著降低、ATGL酶濃度亦明顯升高(P＜0.01)，其中，辛伐他汀組更為顯著；飲食組ATGL酶濃度和TNF-α水平雖然有所恢復(fù)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (表 3)。

5 直線相關(guān)性分析 直線相關(guān)分析結(jié)果顯示血清ATGL酶濃度與TNF-α呈高度負(fù)相關(guān)(r=0.948，P＜0.01)，見圖2。

表2 16周末各組大鼠相關(guān)生化指標(biāo)Tab.2 Biochemical indications for different groups at the end of 16th week(-x±s)

討 論

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化三種類型，其中30%的患者可逐漸演變成脂肪性肝硬化[9]。IR是NAFLD發(fā)生發(fā)展的“初次打擊”[2]，是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在NAFLD的形成過程中，由脂肪組織分泌的重要脂肪因子TNF-α，可隨血液直接進(jìn)入肝臟，誘導(dǎo)和加重IR，促使單純性脂肪肝向脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化演變[3-4]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了正常肝臟在高脂飲食介導(dǎo)下發(fā)展成為脂肪性肝炎的病變過程。模型組大鼠血清TNF-α水平顯著著高于正常對(duì)照組，也再次證實(shí)TNF-α參與了高脂飲食脂肪肝損傷過程[10]。

ATGL是新發(fā)現(xiàn)的又一啟動(dòng)脂動(dòng)員的脂肪分解酶[11-12]，其可特異性脂解甘油三酯，并具有轉(zhuǎn)酰基活性，對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下脂滴大小和甘油三酯儲(chǔ)積具有重要調(diào)控作用。細(xì)胞學(xué)水平的研究表明[13]，TNF-α和胰島素均可明顯下調(diào)ATGL mRNA表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示模型組大鼠經(jīng)長期高脂飲食介導(dǎo)后，血清TNF-α較對(duì)照組顯著升高，而ATGL酶濃度顯著下降，并且兩者之間呈高度負(fù)相關(guān)。因此推測，這可能是由于高TNF-α水平下調(diào)ATGL mRNA表達(dá)而影響血清ATGL酶濃度水平。而ATGL酶活性降低進(jìn)而參與了血脂異常和肝細(xì)胞脂肪變性過程。

本實(shí)驗(yàn)采用臨床上療效肯定的降脂藥物辛伐他汀和非諾貝特來治療NAFLD模型大鼠。結(jié)果顯示，兩藥物組大鼠的糖脂紊亂、肝腎功能異常、肝臟增大、脂質(zhì)沉積以及肝細(xì)胞脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤等均顯著減輕，說明這兩種藥物對(duì)大鼠是有效的。有研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物與非諾貝特不僅可有效降脂，還有抗炎、抗血栓和改善內(nèi)皮功能的作用[14-15]。此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中的兩藥物組大鼠血清TNF-α顯著降低，證實(shí)了兩藥物均有一定的抗炎作用，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似[14,16]，而菲諾貝特較辛伐他汀抗炎效果輕；并且相較于飲食組，兩藥物組血清TNF-α降低顯著，且ATGL酶活性更高。提示兩藥物能夠有效治療大鼠NAFLD，可能與提高了血清ATGL酶活性有關(guān)，而這可能是通過TNF-α的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，兩藥物對(duì)大鼠高血脂性腎損害也有一定的治療作用。

因此，ATGL可能成為治療NAFLD的又一新的靶點(diǎn)，為治療NAFLD提供了新的思路。

圖2 ATGL 和TNF-α直線相關(guān)分析Fig.2 Linear relation of ATGL with TNF-α

表3 16周末各組大鼠血清ATGL 與TNF-α水平Tab.3 Serum ATGL and TNF-αlevels at week 16(-x±s)

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