肖莉春，孔祥峰，黃名錢，郭小權(quán)

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045;2.中國科學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所/湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410125)

豬大腸桿菌病是由某些特定血清型大腸埃希氏桿菌(E.Coli)感染引起的，該病在臨床上的主要表現(xiàn)為嚴(yán)重腹瀉、脫水或敗血癥，患豬生長停滯或死亡，對仔豬危害較大，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。由于臨床上抗菌藥物的濫用導(dǎo)致E.Coli的耐藥菌株不斷出現(xiàn)，耐藥譜不斷擴(kuò)大，嚴(yán)重危害了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[2]。并且長期處在選擇性壓力作用下，病原菌維持耐藥性，且可能通過質(zhì)粒和整合子將耐藥基因在相同或不同種屬細(xì)菌間廣泛轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致多重耐藥，加大了控制病原菌的技術(shù)難度。從動物排放到環(huán)境中的病原菌可以長時間存活，而在環(huán)境中不斷遷移的過程中，病原菌也會通過自身的變異獲得更強(qiáng)的致病力，對人類及動物造成嚴(yán)重威脅。隨著人們對抗菌藥和激素等常規(guī)藥物毒副作用的認(rèn)識不斷加深，以及目前人們對食物安全的廣泛關(guān)注，興起了一股崇尚和回歸自然的浪潮[3]。中藥及天然植物制劑因來源廣、多效等優(yōu)勢，具有藥用、保健和營養(yǎng)等作用，且其毒副作用低、無有害殘留、不易產(chǎn)生耐藥性，有很大的應(yīng)用價值，已愈來愈被國內(nèi)外畜牧獸醫(yī)工作者所重視[4－5]。本試驗制備了29味中藥的水提物和中性醇提物，并采用打孔法、倍比稀釋法測定了其對10個豬源耐藥大腸桿菌分離株和3個標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌菌株的抑制活性，旨在為研制高效抑菌中藥方劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

10個豬源大腸桿菌分離株由揚(yáng)州大學(xué)焦新安教授課題組提供，其編號、血清型、基因型、毒素鑒定情況及耐藥譜如表1、2所示，3個致病大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(K88、K99、K101)由中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所畜禽健康養(yǎng)殖研究中心提供。

表1 10株豬源大腸桿菌分離株的情況Tab.1 Information of 10 isolates of E.Coli from swine farms

表2 10株豬源大腸桿菌分離株的耐藥表型Tab.2 Antibiotics－resistance phenotypes of 10 isolates of E.Coli from swine farms

1.2 中藥提取物制備

試驗選用的29味中藥(表3)均購自湖南省長沙市藥材公司。

表3 中藥來源Tab.3 Resources of Chinese herbs

中藥水提物的制備:取每味中藥各100 g，加500 mL蒸餾水，武火加熱至沸騰，然后改用文火加熱，維持微沸1 h，期間不斷攪拌，4層紗布過濾;在藥渣中再加入500 mL蒸餾水，同法煎煮、過濾。合并濾液，加熱濃縮至1 g/mL，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

中藥中性醇提物的制備:取每味中藥各100 g，加500 mL的80%乙醇于1 000 mL圓底燒瓶中，加熱回流1 h，趁熱過濾;在殘渣中再加入500 mL的80%乙醇，加熱回流1 h，濾出殘渣，合并濾液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中加熱濃縮至1 g/mL，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 中藥提取物對大腸桿菌抑菌圈的測定

將菌株接種于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，然后挑取單個菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌培養(yǎng)6～8 h，用分光光度計測定其OD600值，然后將菌液稀釋成濃度為1×107cfu/mL的菌懸液，取稀釋后的菌懸液100 μL于LB平板內(nèi)，用無菌涂布棒涂勻，再用直徑6 mm的無菌打孔器在每個平皿內(nèi)均勻打5個孔，挑去孔內(nèi)瓊脂，在酒精燈上加熱封底，每孔加入對應(yīng)標(biāo)號的中藥提取物，以剛剛注滿為準(zhǔn)，37℃培養(yǎng)24 h后，測定抑菌圈直徑[6]。

1.4 中藥提取物對大腸桿菌MIC的測定

采用倍比稀釋法[6]。對篩選出具有明顯抑菌活性的中藥提取物，在48孔板上用LB液體培養(yǎng)基將藥液稀釋成500，250，125，62.5，31.25，15.6，7.8 mg/mL 7 個濃度梯度，每孔加入稀釋后的菌液100 μL，混勻后37℃培養(yǎng)24 h。若培養(yǎng)液透明，可直接判定結(jié)果;若培養(yǎng)液色澤較深，不易判定結(jié)果，則在培養(yǎng)結(jié)束后，取適量培養(yǎng)液在固體培養(yǎng)基上劃線接種，培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，以無菌生長的最低稀釋度為各受試提取物的MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥提取物對大腸桿菌的抑菌圈直徑

由表4可見，五倍子醇提物和水提物對受試菌的抑菌圈直徑分別為＞20 mm和9.5～13.0 mm，連翹提取物的抑菌圈直徑均為10.0～14.0 mm;地榆、秦皮提取物對菌株C023、SEC1284均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性;山楂醇提物對菌株 SEC470、SEC817、K101和 SEC1284的抑菌圈直徑分別為 11.0，10.3，10.0，10.0 mm，秦 皮 醇 提 物 對 菌 株 SEC470、C023、SEC1284、K99 和 C193 的 抑 菌 圈 直 徑 分 別為 13.3，10.3，10.3，10.0，10.0 mm，黃連醇提物對菌株 SEC1284、SEC470 和 SEC206 的抑菌圈直徑分別為 16.0，15.0，10.0 mm;大青葉水提物對13 株受試菌的抑菌圈直徑均介于 7.0 ～10.5 mm。

表4 中藥提取物對13株大腸桿菌的抑菌圈直徑Tab.4 Inhibition zone diameter of extracts from Chinese herbs against 13 strains of E.Coli mm

2.2 中藥提取物對大腸桿菌的MIC

由表5可見，五倍子醇提物對13株受試菌的抑制效果最佳，MIC為15.6 mg/mL，而其水提物的MIC為125～250 mg/mL;連翹提取物的抑菌效果次之，MIC為62.5～125 mg/mL;山楂醇提物對13株受試菌的MIC為125～250 mg/mL，而其水提物除對除SEC616、SEC911、C193和C197外的其它菌株的MIC均介于250～500 mg/mL;地榆、黃芩、秦皮和大黃提取物的MIC均偏高，抑菌效果較差;大青葉水提物的MIC為250～500 mg/mL，而其醇提物無抑菌活性;梔子提取物對13株受試菌的抑制效果均不明顯。

表5 中藥提取物對13株大腸桿菌的MICTab.5 MIC of extracts from Chinese herbs against 13 strains of E.Coli mg/mL

3 討論

中藥的抑菌成分主要有生物堿、黃酮、揮發(fā)油、有機(jī)酸和帖類等物質(zhì)。本試驗分別用水提法和中性醇提法制備了29種中藥的提取物，并比較了其對耐藥性大腸桿菌的抑制作用。結(jié)果表明，11種中藥的兩種提取液對13株受試菌均有不同程度的抑制作用。其中，五倍子醇提物對13株受試菌，秦皮醇提物對 K88、K101、SEC206、SEC470、SEC616、SEC1284 和 C197，石榴皮醇提物對 K99、C023、SEC470、SEC1284和C193，黃連醇提物對SEC206、SEC470和SEC1284，大黃醇提物對SEC1284的抑制作用均大于其水提物，這與以往報道五倍子[7]、秦皮[8]、石榴皮[9]和大黃[10]醇提物的抑菌效果最佳相符。在 13株受試菌中，黃連提取物對SEC470和SEC1284、地榆提取物對C023和SEC817、大黃提取物對SEC1284抑菌活性較強(qiáng)，對其它菌株的抑制作用較弱或無抑菌效果?？梢?，同種中藥的不同提取方法所得的提取液對同一菌株的抑制作用有顯著差異，同一中藥提取液對不同菌株的抑制作用也存在差異。

水提法以水為溶劑，操作簡便，成本低，但其選擇性差，只有一些無機(jī)鹽、可溶性多糖、鞣質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸鹽等成分能被溶出。水提過程中溫度較高，極可能破壞熱穩(wěn)定性較差的有效成分，使其提取液的抑菌效果較弱[11]。乙醇的溶解性能比水好，對中藥細(xì)胞的穿透能力較強(qiáng)，醇提液中除了含有水溶性成分還含有脂溶性成分。目前研究認(rèn)為，五倍子的主要抑菌成分為五倍子鞣質(zhì)和沒食子酸等，可使微生物體內(nèi)的原生質(zhì)凝固[12];黃連的有效抑菌成分為小檗堿，黃芩的主要抑菌成分為黃芩甙[13]，秦皮的抑菌成分為秦皮甲素和秦皮乙素(香豆精)等[14]，石榴皮的抑菌成分為黃酮和鞣質(zhì)等[15]，大黃的抑菌成分為大黃素、蘆薈大黃素和大黃酸等[16]。在上述抑菌成分中，生物堿、黃酮類、揮發(fā)油、帖類、蒽醌和香豆精等均能溶于乙醇，所以中藥醇提物的抑菌作用一般強(qiáng)于其水提物。

綜上所述，本試驗篩選出了幾種對豬源耐藥大腸桿菌分離株具有較強(qiáng)抑制作用的中藥提取物，為研制高效抑菌中藥方劑提供了依據(jù)。某些中藥成分在體內(nèi)代謝可生成無效或低效的代謝產(chǎn)物;而一些在體外無抑菌活性的成分，通過體內(nèi)代謝可產(chǎn)生具有較強(qiáng)抑菌活性的代謝產(chǎn)物。因此，需進(jìn)一步通過體內(nèi)試驗并結(jié)合臨床用藥效果觀察，才能最終篩選出效果良好的抑菌中藥。

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