陸海蓮，吳 春，劉 寧

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱150076)

黑米被認(rèn)為是稻米中的珍品，又稱烏米，是禾本科植物，黑米素有“神仙米”、“藥米”、“長(zhǎng)壽米”之稱，是民間滋補(bǔ)佳品.已有研究表明，黑米具有抗氧化、消除自由基、抗炎、抗變異、抗腫瘤、提高免疫力等功能，這些保健功能與其種皮含有豐富的花色苷類物質(zhì)有很大關(guān)系[1－2].花色苷是一種黃酮類的化合物，也是黑米呈現(xiàn)黑色的主要原因.同時(shí)黑米花色苷作為一種天然食用色素，安全、無(wú)毒、無(wú)異味、色彩鮮艷、資源豐富，在食品、醫(yī)藥、化妝品等方面有著較大的應(yīng)用潛力[3－5].在黑米中提取黑米花色苷時(shí)往往有較多的雜質(zhì)，很難進(jìn)行鑒定，對(duì)其進(jìn)行分離提純是非常重要的.目前國(guó)內(nèi)外對(duì)黑米花色苷的純化廣泛采用大孔吸附樹(shù)脂法，具有操作簡(jiǎn)便、性質(zhì)穩(wěn)定、成本低、效率高、容易再生等優(yōu)點(diǎn)[6－7].本試驗(yàn)以膳食黑米為原料，利用 AB －8 大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，研究其純化最佳條件，旨在為工業(yè)化分離純化黑米花色苷提供理論依據(jù)與技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

材料:黑米，市售(黑龍江省五常市)，AB－8型大孔樹(shù)脂(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)

試劑:36% ～38%鹽酸、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、石油醚等(均為國(guó)產(chǎn)分析純).

儀器設(shè)備:DFY－500型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)、FA2004N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、pHS－25型酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠)、KQ3200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、LD－2A型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)、721E型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)、SHZ－A水浴振蕩器(上海申勝生物技術(shù)有限公司)、SHB－III型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科貿(mào)有限公司)、R－205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司)、FDU－1200型真空冷凍干燥箱(東京RIKAKIKAI有限公司)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑米花色苷粗提液的制備

黑米粉碎后，過(guò)60目篩，得到黑米粉.稱取一定量的黑米粉，在超聲波輔助的情況下，用pH值約為2的80%的乙醇提取劑按料液比為1∶10、60℃超聲20 min后，過(guò)濾浸提液，用等體積的石油醚萃取3次，下層粗提掖合并得到脫脂粗提液.將粗提液減壓濃縮除去乙醇，真空冷凍干燥后，得到黑米花色苷粗提物粉末.

1.2.2 黑米花色苷得率和總花色苷質(zhì)量比的計(jì)算

粗提物得率按下式計(jì)算:

純化后花色苷的得率為:

黑米花色苷質(zhì)量比的測(cè)定:

準(zhǔn)確稱取一定量的花色苷提取物于100 mL容量瓶中定容，在分光光度計(jì)上測(cè)定530 nm處的吸光度，按公式(3)計(jì)算花色苷質(zhì)量比[8]:其中:V為花色苷溶液定容體積mL;N為稀釋倍數(shù);98.2為花色苷色素在530 nm處的平均消光系數(shù);W為提取物重(g).

1.3 黑米花色苷粗提物的純化

1.3.1 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理

取一定量的AB－8大孔樹(shù)脂，用95%的乙醇浸泡24 h，然后用蒸餾水洗至洗出液無(wú)色、無(wú)混濁且無(wú)醇為止.

1.3.2 大孔樹(shù)脂對(duì)黑米花色苷的靜態(tài)吸附—解吸試驗(yàn)1)大孔樹(shù)脂吸附率和解吸率的測(cè)定樹(shù)脂吸附率和解吸率的計(jì)算如下:

其中:A0為提取液在最大吸收波長(zhǎng)(530 nm)處的吸光值，A1為大孔樹(shù)脂充分吸附后溶液的吸光度值;A2為吸附花色苷后的樹(shù)脂用乙醇洗脫后的溶液吸光度值.

2)吸附平衡時(shí)間的確定

取已預(yù)處理好的樹(shù)脂1.0 g，加入黑米花色苷提取液25 mL，調(diào)pH值約為2.0，封口置恒溫振蕩器上于30℃、150 r/min振蕩，每隔0.5h測(cè)溶液的吸光度值，直到數(shù)值穩(wěn)定.

3)解吸平衡時(shí)間的確定

取吸附飽和的樹(shù)脂1.0 g，加入60%乙醇溶液25 mL，每隔0.5 h測(cè)溶液的吸光度值，直到數(shù)值穩(wěn)定.

4)黑米花色苷溶液pH值對(duì)吸附效果的影響

準(zhǔn)確稱取1.0 g預(yù)處理過(guò)的大孔樹(shù)脂，加入25 mL 黑米花色苷溶液，調(diào) pH 值 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0后，計(jì)算吸附率.

5)不同洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸效果的影響

稱取1.0 g吸附飽和的AB－8樹(shù)脂5份，分別用20%、40%、60%、80%、95% 的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，計(jì)算不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)黑米花色苷的解吸率.

1.3.3 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附特性的研究

1)上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響

配制質(zhì)量濃度為 0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mg/mL的黑米花色苷溶液，分別通過(guò)樹(shù)脂柱，計(jì)算吸附率.

2)上樣液流速對(duì)吸附效果的影響

改變黑米花色苷溶液流速，分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min，計(jì)算吸附率.

3)洗脫流速對(duì)解吸效果的影響

洗脫劑乙醇分別用 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min的流速，通過(guò)吸附飽和的樹(shù)脂柱，計(jì)算解吸率.

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔樹(shù)脂對(duì)黑米花色苷靜態(tài)吸附性能的研究

2.1.1 吸附平衡時(shí)間的確定

由圖1可以看出，隨著時(shí)間的增加，大孔樹(shù)脂對(duì)黑米花色苷的吸附率增大，當(dāng)時(shí)間為4 h時(shí)，吸附率基本無(wú)變化，說(shuō)明大孔樹(shù)脂已經(jīng)吸附飽和，所以本實(shí)驗(yàn)確定最佳吸附時(shí)間為4 h.

圖1 吸附平衡時(shí)間的確定

2.1.2 解吸平衡時(shí)間的確定

由圖2可以看出，隨著時(shí)間的增加，解吸率增大，當(dāng)時(shí)間為1.5 h時(shí)，解吸率基本保持不變，說(shuō)明已經(jīng)充分洗脫，從時(shí)間的角度考慮，本實(shí)驗(yàn)最終確定解吸時(shí)間為1.5 h.

圖2 解吸平衡時(shí)間的確定

2.1.3 吸附液pH值的確定

花色苷為黃酮類化合物，具有一定的極性和酸性，所以吸附液pH值對(duì)花色苷類化合物的吸附率會(huì)有一定影響.由圖3可知，當(dāng)吸附液pH值偏大時(shí)，吸附率反而降低，這是因?yàn)楫?dāng)pH較大時(shí)，黑米花色苷因離子化趨勢(shì)而不易被吸附，因此選擇吸附液pH值為2.0.

圖3 吸附液pH值對(duì)吸附效果的影響

2.1.4 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的確定

由圖4可以看出隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，解吸率增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，基本可以達(dá)到充分解吸，繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，解吸率并沒(méi)有明顯增大，所以從節(jié)省原料的角度考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%.

圖4 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸效果的影響

2.2 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附性能的研究

2.2.1 上樣液質(zhì)量濃度的確定

由于花色苷在水中溶解度比較小，所以本實(shí)驗(yàn)選擇較小的上樣液質(zhì)量濃度，由圖5可以看出，隨著上樣液質(zhì)量濃度的增大，大孔樹(shù)脂對(duì)花色苷的吸附率呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，這是因?yàn)殡S著花色苷溶液質(zhì)量濃度的增大，樹(shù)脂的吸附能力有限并不能將其吸附完全，因此上樣液質(zhì)量濃度選擇0.5 mg/mL.

圖5 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響

2.2.2 上樣液流速的確定

由圖6可以看出，隨著流速的增加，大孔樹(shù)脂對(duì)花色苷吸附率明顯下降，原因是吸附是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，在相同的吸附條件下流速加快必然使吸附的時(shí)間減少，流速過(guò)快花色苷來(lái)不及擴(kuò)散到樹(shù)脂的內(nèi)表面而未吸附，導(dǎo)致吸附率降低，即高流速不利于大孔樹(shù)脂對(duì)花色苷的吸附，流速過(guò)低影響試驗(yàn)周期，因此選擇1.0 mL/min為最佳上樣液流速.

圖6 上樣液流速對(duì)吸附效果的影響

2.2.3 洗脫流速的確定

由圖7可以看出，高流速不利于洗脫劑對(duì)大孔樹(shù)脂的解吸，原因是洗脫劑不能與被吸附的花色苷充分作用，進(jìn)而不能將花色苷從樹(shù)脂上洗脫下來(lái)，本實(shí)驗(yàn)選擇1.0 mL/min為最佳洗脫流速.

圖7 洗脫流速對(duì)解吸效果的影響

2.3 黑米花色苷得率及質(zhì)量比的計(jì)算結(jié)果

按公式(1)、(2)計(jì)算黑米花色苷得率和質(zhì)量比結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 黑米花色苷的得率及質(zhì)量比

3 結(jié)語(yǔ)

由靜態(tài)和動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果可知，AB－8型大孔樹(shù)脂具有良好的吸附能力，靜態(tài)試驗(yàn):當(dāng)時(shí)間為4 h時(shí)能完全吸附，當(dāng)時(shí)間為1.5 h、60%乙醇洗脫劑就能將其充分解吸，吸附液pH值為2.0時(shí)吸附效果比較好;動(dòng)態(tài)試驗(yàn):上樣液質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL、上樣液流速為1.0 mL/min時(shí)，解吸流速控制在1.0 mL/min，從時(shí)間周期和吸附效果來(lái)說(shuō)比較好.用AB－8型大孔樹(shù)脂純化花色苷質(zhì)量比由原來(lái)的16.90 mg/g提高到131.77 mg/g，由此可知 AB －8型大孔樹(shù)脂對(duì)黑米花色苷的純化效果還是比較理想的.

[1] 郭紅輝，凌文華.黑米花色苷研究進(jìn)展[J].食品研究與發(fā)展，2008，29(3):133 －135.

[2] 孫 玲，張名位，池建偉，等.黑米的抗氧化性及其與黃酮和種皮色素的關(guān)系[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2000，22(3):246－249.

[3] 李莉蓉，劉鄰渭，張名位.3種黑色糧油作物種皮花色苷的抗氧化作用及其理化特性比較[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué).2006.

[4] TOSHIO K，MASAHARU K，TAKAHISA M.Anthocyanin Pigment Extracting Characteristics from Black Rice[J].Shokubutsu Kankyo Kogaku，2005，17(2):84 －87.

[5] 侯召華，翟虎渠，萬(wàn)建民，等.黑米花色苷的提取及純化[J].食品科學(xué)，2008，31(10):53－59.

[6] 孟憲軍，李穎暢.AB－8大孔樹(shù)脂對(duì)藍(lán)莓花色苷的動(dòng)態(tài)吸附與解吸特性研究[J].食品工業(yè)科技，2007(12):94－97.

[7] 侯方麗，張名位.黑米皮花色苷的大孔樹(shù)脂吸附純化研究[J].華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2009(1):100－104.

[8] LEE J H.Identification and quantification of anthocyanins from the grains of black rice(Oryza sativa L)varieties[J].Food science and biotechnology，2010，19(2):391－397.