廉慧鋒 （山西出入境檢驗(yàn)檢疫局 太原 030024）

胡傳偉 李 葉 賈 赟 （遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局 大連）

水貂阿留申病(Aleutian disease of mink, AMD)是由阿留申病病毒(Aleutian disease virus, ADV)引起的一種水貂的傳染病。該病毒屬細(xì)小病毒科，是一種單鏈的DNA病毒，長度大約4800bp[1，2],在水貂中主要引發(fā)兩種不同類型的疾病。成年水貂感染ADV后，表現(xiàn)出典型的水貂阿留申病，以體內(nèi)產(chǎn)生高水平的γ-球蛋白，漿細(xì)胞增多，持續(xù)性病毒血癥及由免疫復(fù)合物(immune complex，IC)沉積引發(fā)的嚴(yán)重腎小球腎炎等為主要癥狀。而新生幼貂感染該病后，病毒在病貂體內(nèi)肺泡II型細(xì)胞中迅速大量繁殖，表現(xiàn)出一種急性致死性的間質(zhì)性肺炎。另外，這兩種不同的急、慢病癥在有些水貂中的表現(xiàn)輕微或某些水貂感染ADV后不出現(xiàn)明顯感染癥狀的情況，也有相關(guān)報(bào)道。

國外對目前ADV和AD的研究較為深入,主要集中在ADV分子病原學(xué)及AD分子水平的發(fā)病機(jī)理的探討。目前國外已報(bào)道從不同地區(qū)分離到的多株ADV毒株，如ADVG、DV-Utah1、ADV-K等[3～7]。通過對這些毒株的基因進(jìn)行對比分析,發(fā)現(xiàn)ADV具有高度的遺傳多樣性[7,8,9]。國內(nèi)對AD的研究起步晚,研究內(nèi)容比較局限,尤其是基因水平的研究較少。筆者應(yīng)用對流免疫電泳和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)2種方法對遼寧某水貂養(yǎng)殖場的水貂進(jìn)行ADV檢測，對PCR產(chǎn)物應(yīng)用序列分析的方法證實(shí)分離到一株ADV病毒，命名為LN-1。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 感染陽性病料樣品的采集和處理 從遼寧某水貂養(yǎng)殖場具有水貂阿留申病臨床癥狀并且應(yīng)用對流免疫電泳檢測陽性水貂肺、肝、腎、腸系膜淋巴結(jié)。

1.1.2 主要試劑 CIEP檢測試劑，購自吉林左家特產(chǎn)研究所；TaqDNA聚合酶、dNTP、等均購自寶生物(大連)工程有限公司；組織/細(xì)胞DNA抽提試劑盒為上海華舜生物工程有限公司的產(chǎn)品。

1.1.3 菌種與質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD-18T載體購自于大連寶生物工程公司。

1.1.4 引物 根據(jù)Genbank上發(fā)表的ADV標(biāo)準(zhǔn)毒株ADV-G的LORF的基因序列設(shè)計(jì)了一對引物，P1：5’-AAC CAA GCA AGG TGG AAA G-3’(1459-1477)，P2：5’-ATT CTT CGT GGC AGT TGT G-3’(2067-2085)，預(yù)期的擴(kuò)增片斷為627bp。

1.1.6 儀器設(shè)備 System9700型常規(guī)PCR擴(kuò)增儀購自美國ABI公司、UVP GelDoc-lt凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 樣品中DNA提取 樣品中總DNA的提取按照組織DNA抽提試劑盒說明書提供的方法進(jìn)行；質(zhì)粒提取按文獻(xiàn)方法進(jìn)行[10]。

1.2.2 PCR條件的設(shè)置 （1）PCR反應(yīng)體系：cDNA3μl，10×PCR緩沖液2.5μl，25mmol/LMgCl22μL，10mmol/L dNTP1μl，P1(20pmol)0.5μl，P2(20pmol)0.5μl，Taq酶(5U/μl)0.25μl，加H2O補(bǔ)至20μl。（2）反應(yīng)條件：96℃變性4min，96℃30s，50℃1min，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。反應(yīng)完畢，取PCR產(chǎn)物6μl，置15%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，紫外線燈下觀察。

1.2.3 膠回收、連接以及酶切鑒定 選擇肝臟和腸系膜淋巴結(jié)樣品擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit切膠回收，使用TaKaRa DNA Ligation Kit中的Solution I，將回收的PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體上后命名為CTA544，熱轉(zhuǎn)化至E.coli Competent Cell JM109中，涂布平板過夜培養(yǎng)菌體。從轉(zhuǎn)化平板上挑選單菌落使用RV-M/M13-47引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測菌落中插入片段的長度，瓊脂糖凝膠電泳，選擇陽性克隆使用M13-47、RV-M引物測序。

1.2.4 序列測定及分析 將含有目的基因的陽性菌液送大連寶生物公司測序，將所得的病毒株的基因序列與GenBank中檢索到的美國ADV的代表株ADV-Utah1、無致病力的ADV-G及歐洲的代表株ADV-K相對應(yīng)序列及基于這些基因預(yù)測的氨基酸序列利用DNASTAR分析軟件進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 PCR試驗(yàn)結(jié)果

從圖1中可以看出P1/P2引物能夠特異的擴(kuò)增ADV基因長度約為600bp片段，而空白對照為擴(kuò)增出任何條帶，見圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 重組后質(zhì)粒DNA使用M13-47、RV-M引物測序結(jié)果

圖3 ADV分離株LN-1株與國外報(bào)道的毒株同源性分析

進(jìn)化樹分析顯示:本次分離到的此株病毒基因與美國ADV的代表株ADV-Utah1、無致病力的ADV-G病毒基因處在比較近的進(jìn)化分支上，而與歐洲的代表株ADV-K的基因的系統(tǒng)關(guān)系相對較遠(yuǎn)（圖4），因此可以鑒定此株細(xì)小病毒。

圖4 DV(分離株LN-1與國外參考毒株)的基因發(fā)育進(jìn)化樹

2.2 序列測定及分析

序列測定結(jié)果從圖2中可以看出P1/P2引物擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為627bp，與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物的大小一致，將含有目的基因的陽性菌液送大連寶生物公司測序，將所得的基因序列與GenBank中檢索到的美國ADV的代表株ADVUtah1、無致病力的ADV-G及歐洲的代表株ADV-K相對應(yīng)序列及基于這些基因預(yù)測的氨基酸序列利用DNASTAR分析軟件進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。同源性結(jié)果顯示：擴(kuò)增得到的基因片段與ADV-Utah1的同源性最高，高達(dá)95.4%，與ADV-G，ADV-K的同源性分別為95.2%，87.2%(圖3)。

3 討論

水貂阿留申病在水貂飼養(yǎng)場普遍存在，臨床上主要表現(xiàn)的癥狀為水貂產(chǎn)仔量降低、死胎、流產(chǎn)、腎小球腎炎、動脈血管炎和肝炎，并導(dǎo)致成年水貂的免疫系統(tǒng)紊亂，仔貂突發(fā)嚴(yán)重肺炎而死亡。病理剖檢常見的是腎腫大、充血而呈紅色，后變灰褐色或淡黃褐色，有的表面可見斑點(diǎn)狀出血，間有灰白色壞死灶。水貂阿留申病的發(fā)病率和死亡率都很高，同時(shí)病貂毛皮質(zhì)量下降，對水貂養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是世界上公認(rèn)的養(yǎng)貂的三大疫病之一。

目前國內(nèi)外尚未研制出有效預(yù)防AMD的疫苗，仍只能通過檢疫淘汰病貂來實(shí)現(xiàn)對本病的控制和根除，對流免疫電泳(CIEP)是現(xiàn)今世界公認(rèn)的并且是應(yīng)用最為廣泛的檢測方法。目前，應(yīng)用PCR方法檢測水貂阿留申病毒的方法的研究也比較少，國內(nèi)還沒有應(yīng)用熒光定量PCR檢測水貂阿留申病的報(bào)道。

本試驗(yàn)主要對水貂群進(jìn)行了ADV的檢測并分離到了一株水貂阿留申細(xì)小病毒株并進(jìn)行了鑒定，也對其進(jìn)行了基因的初步分析，這對將來進(jìn)一步開展針對該病的診斷和防治研究奠定了基礎(chǔ)，對今后深入研究我國AMDV遺傳多樣性、抗原變異情況以及水貂阿留申病的預(yù)防和控制都具有重要意義。

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