蔣學(xué)偉，馬克濤，李麗，趙磊，魏麗麗，陳新燕，司軍強(qiáng)

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室／新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002）

我國(guó)每年因?yàn)樾摹⒛X血管相關(guān)性疾病死亡的人數(shù)約有260萬(wàn)人，平均每小時(shí)死亡約300人，成為人類健康的頭號(hào)殺手。同時(shí)，由于環(huán)境的污染、飲食習(xí)慣的改變和生活節(jié)奏的加快，促使心、腦血管相關(guān)疾病的發(fā)病率和病死率逐年上升。2009年新疆監(jiān)測(cè)縣居民死因監(jiān)測(cè)分析，循環(huán)系統(tǒng)疾病仍居于首位［1］。

如上所述，心腦血管相關(guān)疾病作為危害人類生命和健康的最嚴(yán)重的疾病，其發(fā)病關(guān)鍵部位是血管［2］。而微小動(dòng)脈決定了血管的外周阻力，即血液循環(huán)的阻力主要在微小血管節(jié)段形成，血壓落差達(dá)90%［3］。因此，對(duì)微小動(dòng)脈的研究也就凸顯其重要性和必要性，應(yīng)用壓力肌動(dòng)圖技術(shù)對(duì)微小動(dòng)脈的研究已成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)研究的主要方法之一。其優(yōu)點(diǎn)在于，微小動(dòng)脈段易于制備且細(xì)胞生理功能保存較好，通過(guò)對(duì)血管的孵育，能夠使血管較好的接近于正常生理狀態(tài)。為研究微小動(dòng)脈血管舒縮活動(dòng)的特性以及血管活性物質(zhì)對(duì)血管的作用機(jī)制的研究提供了一種新的技術(shù)。

1 材料與方法

1．1 標(biāo)本的制備

實(shí)驗(yàn)用Wistar大鼠，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證編號(hào)SCXK新2003－0001）。體重在200～250g，雌雄不拘，清潔級(jí)。將大鼠以戊巴比妥鈉（50mg／kg）麻醉后斷頭處死，迅速打開腹腔，找到胃幽門部，迅速取近幽門10cm內(nèi)的帶系膜的腸管，沿腸系膜血管走行方向扇形剪斷，將其放置于已用95%O2、5%CO2混合氣體氧飽和的4℃的生理鹽溶液（Physiological Saline Soulution，PSS）中。PSS成分是（mmol／L）：NaCl 118．9，KCl 4．69，Mg－SO4·7H2O 1．17，KH2PO41．18，CaCl22．5，NaHCO325，EDTA 0．026，葡萄糖5．5，充入混合氣體95%O2、5%CO2調(diào)節(jié)pH 至7．40。

1．2 動(dòng)脈血管的分離和套接

將標(biāo)本固定于帶固定膠裝有PSS液的培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下用微細(xì)組織鑷與維納斯剪小心分離腸系膜血管2級(jí)動(dòng)脈分支，注意區(qū)分動(dòng)靜脈，清除血管周圍結(jié)締組織，避免損傷內(nèi)皮。剪取2－3mm無(wú)分支的血管段后，放置于PSS液的灌流槽內(nèi)。將血管一端套接在管口直徑約為50μm的玻璃插管（玻璃插管用P－2000拉制儀拉制）上，用10－0眼科尼龍線扎牢，用注射器緩慢沖走血管內(nèi)的殘留血液；再將血管另一端套在另一根玻璃插管上。

1．3 實(shí)驗(yàn)裝置的連接

將已扎好血管的灌流槽移至壓力型小動(dòng)脈測(cè)量?jī)x（Pressure myograph system，DMT，110P，Denmark）的倒置顯微鏡臺(tái)上，放大倍數(shù)為10倍（目鏡）×10倍（物鏡）。將P1端與裝有PSS液的外液瓶連接，P2端與廢液瓶連接，然后用裝有PSS液的5mL注射器緩慢將P1端與外液瓶和P2端與廢液瓶間的氣體排掉，以保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程中血管段內(nèi)無(wú)殘留氣體，操作期間注意手法要輕，以免損壞壓力感受器。將浴槽中恒速通以95%O2、5%CO2混合氣體，溫度維持在37℃。

1．4 動(dòng)脈血管段活性的平衡

初始平衡階段保持液體流入P1壓力為20mm－Hg、P2壓力5mmHg，持續(xù)時(shí)間為3min，以沖走血管內(nèi)的殘留物；之后液體流入P1、流出P2端均調(diào)至10mmHg，以10mmHg為一個(gè)梯級(jí)，使管腔內(nèi)壓力逐漸增加到60mmHg，每個(gè)梯級(jí)停留5min。管腔內(nèi)壓力增至60mmHg后，血管段在PSS液中再穩(wěn)定1h，平衡期間每20min更換浴槽內(nèi)液體一次。

1．5 血管收縮和舒張功能檢測(cè)

血管段在PSS液中平衡1h后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化［4］。孵育30min，先用血管活性劑去甲腎上腺素（10－8mol／L，norepinephrine，NE）激發(fā)動(dòng)脈段收縮，收縮達(dá)到最大或平穩(wěn)后，用乙酰膽堿 （10－5mol／L，acetylcholine，ACh）舒張，之后用PSS液洗滌四次，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)。在標(biāo)準(zhǔn)化中，以 K－PSS液（potassium physiological saline solution，125mmol／L KCl）檢測(cè)動(dòng)脈段收縮性，兩次收縮幅度相差小于10%，用ACh舒張時(shí)，舒張率大于80%認(rèn)為內(nèi)皮完整，可用于實(shí)驗(yàn)。

K－PSS溶 液 成 分 是 （mmol／L）：KCl 123．70，MgSO4·7H2O 1．17，KH2PO41．18，CaCl22．5，NaHCO325，EDTA 0．026，葡萄糖5．5，充入混合氣體95%O2、5%CO2調(diào)節(jié)pH 至7．40。

1．6 記錄藥物對(duì)微小動(dòng)脈段離體標(biāo)本作用前后血管直徑的變化

血管檢測(cè)符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)后，開始實(shí)驗(yàn)，用Myoview軟件（丹麥DMT公司）控制血管內(nèi)壓力穩(wěn)定在60mmHg，溫度維持在37℃。打開負(fù)壓吸引器，將水浴槽內(nèi)的PSS液控制在5mL，依次用微量移液器（德國(guó)Eppendof公司）向浴槽中（5mL）以累積法依次加入血管用藥，在血管反應(yīng)達(dá)到最大值或穩(wěn)定狀態(tài)加入高一級(jí)濃度，分別觀察該藥物對(duì)血管直徑的作用，并記錄血管段在PSS中的血管直徑穩(wěn)定值（Dp）及實(shí)驗(yàn)用藥后，引起血管直徑變化后的穩(wěn)定值（Dx）。

血管直徑變化按下式計(jì)算：

直徑變化（μm）＝Dp－Dx。

1．7 實(shí)驗(yàn)試藥

苯腎上腺素 （phenylephrine，PE）、乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）、均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、氯化鉀（KCl）及其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17．0分析軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以ˉX±S表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)用離體微小動(dòng)脈血管段標(biāo)本直徑為361．945±11．145μm（n＝6），血管經(jīng)過(guò)標(biāo)化后，開始實(shí)驗(yàn)。用微量移液器（德國(guó)Eppendof公司）依次向浴槽中（5mL）以累積法依次加入不同濃度的PE，在血管收縮達(dá)到收縮穩(wěn)定后加入高一級(jí)濃度，其最終濃度依次為0．1、0．3、1、3、10、30、100μmol／L（圖2），分別觀察PE對(duì)血管直徑的作用，并測(cè)量所需數(shù)據(jù)。血管直徑變化按下式計(jì)算：直徑變化（μm）＝DP－DPE。式中：DP為血管段在PSS中的血管直徑穩(wěn)定值，DPE為PE引起血管收縮后的直徑穩(wěn)定值。PE各濃度（0．1、0．3、1、3、10、30、100μmol／L）引起血管直徑變化值分別為：3．07±2．03；17．86±7．84；41．60±11．93；130．45±21．39；186．91±15．82；196．61±13．73；197．58±12．39（單位）（n＝6）。圖3顯示，PE引起血管直徑收縮的幅度經(jīng)標(biāo)化后，可見當(dāng)PE濃度≤0．3μmol／L時(shí)，血管直徑基本沒(méi)有變化（P＞0．05）；當(dāng)PE濃度為1μmol／L時(shí)，血管收縮程度明顯（P＜0．05）；當(dāng)PE濃度＞3μmol／L，血管收縮程度進(jìn)一步增加（P＜0．01）。PE對(duì)血管直徑的收縮作用呈濃度依賴性。

3 討論

微動(dòng)脈是小動(dòng)脈的分支，和小動(dòng)脈共同決定了血管的外周阻力。微小動(dòng)脈血管由內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞組成，其中內(nèi)皮細(xì)胞間、平滑肌細(xì)胞間，內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞間都存在著大量的由縫隙連接介導(dǎo)的電和化學(xué)信號(hào)交流。這就使得血管壁能夠在縱向上和橫向上保持電活動(dòng)、機(jī)械活動(dòng)的同步，使得整個(gè)血管成為統(tǒng)一的功能單位，對(duì)興奮或非興奮作出統(tǒng)一的反應(yīng)，維持了血管生理功能的穩(wěn)定和一致［5－7］。病理情況下，細(xì)胞間縫隙連接的機(jī)構(gòu)和功能受到損傷，使血管細(xì)胞間的同步收縮發(fā)生障礙［8］。血管相關(guān)性疾?。ㄈ缧?、腦血管?。┑陌l(fā)生、發(fā)展與阻力血管功能改變密切相關(guān)［9－10］。血管緊張度反應(yīng)是微小動(dòng)脈對(duì)血管內(nèi)壓力改變而發(fā)生自主性收縮的一種內(nèi)在特性，對(duì)于維持微小動(dòng)脈功能具有重要的作用。當(dāng)壓力在一定范圍內(nèi)波動(dòng)時(shí)，小動(dòng)脈可依據(jù)這種特性，自動(dòng)調(diào)節(jié)壓力和血管管徑之間的關(guān)系，進(jìn)而保證器官血流量的穩(wěn)定［11］。所以，在神經(jīng)遞質(zhì)和藥物等血管活性物質(zhì)的研究中，一般選用微小動(dòng)脈作為研究對(duì)象。對(duì)微小動(dòng)脈的研究，應(yīng)用壓力肌動(dòng)圖技術(shù)能夠更好地研究其舒縮活動(dòng)的特性以及血管活性物質(zhì)對(duì)血管的作用機(jī)制。

壓力肌動(dòng)圖技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）標(biāo)本易于制備，且對(duì)血管損傷較小，人工去除腸系膜動(dòng)脈周圍組織暴露出血管，即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不必做任何有損血管活性的處理。2）能夠直觀準(zhǔn)確的記錄微小動(dòng)脈血管直徑的變化幅值及血管壁的厚度。3）實(shí)驗(yàn)是在血管內(nèi)等壓情況下進(jìn)行，研究神經(jīng)遞質(zhì)和藥物直接作用于血管，能夠更好的模擬動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，應(yīng)用不同濃度血管收縮劑PE作用血管，能夠很直觀、清楚地記錄血管直徑的變化，能直觀的觀察藥物對(duì)微小動(dòng)脈舒縮活動(dòng)的影響。總之，通過(guò)壓力肌動(dòng)圖技術(shù)，研究血管壁細(xì)胞間縫隙連接的作用，以及神經(jīng)遞質(zhì)和藥物等血管活性物質(zhì)對(duì)微小動(dòng)脈舒縮活動(dòng)的影響，能夠進(jìn)一步拓寬對(duì)心腦血管疾病研究。

［1］羅衛(wèi)平，馬江平，劉來(lái)新，等．新疆監(jiān)測(cè)縣居民死因監(jiān)測(cè)分析［J］．疾病預(yù)防控制通報(bào)，2011，26（2）：37－40．

［2］Segal SS．Regulation of blood flow in microcirculation［J］．Microcirculation，2005，12：33－45．

［3］孫寧玲．高血壓治療學(xué)［M］，人民衛(wèi)生出版社，2009：185－186．

［4］Sonoyama K，Greenstein A，Price A，et al．Vascular remodeling：implications for small artery function and target organ damage［J］．Ther Adv Cardiovasc Dis，2007，1（2）：129－137．

［5］Alonso F，Boittin F X，Beny J L，et al．Loss ofconnexin40 is associated with decreased endothelium－dependent relaxations and Enos levels in the mouse aorta［J］．American Journal of Physiology，2010，299：1365－1373

［6］Matchkov V V．Mechanisms of cellular synchronization in the vascular wall．Mechanisms of vasomotion［J］．Danish medical bulletin，2010，57：4191

［7］Milkau M，Kohler R，Wit C．Crucial importance of the endothelial K＋channel SK3and connexin40in arteriolar dilations during skeletal muscle contracyion［J］．Faseb J，2010，24：3572－3579．

［8］Schmidt V J，Wolfle S E，Boettcher M，et al．Gap junctions synchronize vascular tone within the microcirculation［J］．Phanmacol Rep，2008，60：68－74．

［9］Cerqueira N F，Hussni C A，Yoshida W B．Pathophysiology of mesenteric ischemia／reperfusion：a review［J］．Acta Cir Bras，2005，20（4）：336－343．

［10］Park W S，Son Y K，Kim N，et al．Acute hypoxia induces vasodilation and increases coronary blood flow by activating inward rectifier K＋channels［J］．Pflugers Arch，2007，454（6）：1023－1030．

［11］Brayden J E，Earley S，Nelson M T，Reading S．Transient receptor potential（TRP）channels，vascular tone and autoregulation of cerebral blood flow［J］．Clin Exp Pharmacol Physiol，2008，35（9）：1116－1120．