李翰翔，丁曉玲，徐茂義，沈忠飛 (嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001)

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下可分化為多種功能細(xì)胞，根據(jù)發(fā)育階段不同分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow－derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓基質(zhì)系統(tǒng)中的一類多能干細(xì)胞，具有向中胚層和神經(jīng)外胚層來源組織細(xì)胞分化的能力。BMSCs獲取簡便，分離培養(yǎng)較容易，移植排斥反應(yīng)較弱，植入反應(yīng)較為理想。哺乳動物來源的BMSCs是具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，相關(guān)研究證實其有強烈的成骨潛能［1］，因此BMSCs被認(rèn)為是一種理想的骨組織工程種子細(xì)胞，其成骨誘導(dǎo)成為近來研究的熱點。

1 BMSCs的特性及分化潛能

1.1 BMSCs的生物學(xué)特性:間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)來源于中胚層，主要存在于器官間質(zhì)和結(jié)締組織中，在骨髓組織中含量最多，統(tǒng)稱為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)。BMSCs具有成體干細(xì)胞的兩個特征:一是能在很長一段時間內(nèi)準(zhǔn)確地自我復(fù)制，即長期自我更新;二是能分化為具有一定形態(tài)特征和特定功能的成體細(xì)胞，代替因疾病或損傷凋亡的細(xì)胞，在一定程度上維持細(xì)胞的動態(tài)平衡。此外，BMSCs還具有異質(zhì)性、貼壁性、可移植性和快速克隆的能力［2］。BMSCs細(xì)胞表面可表達CD29、CD44、CD90、CD124等，其中粘附分子 CD44是多種配體的受體，其分別在骨和骨髓中對構(gòu)建細(xì)胞外基質(zhì)起重要作用，BMSCs對CD44的強表達表明其在骨髓中有助于骨髓基質(zhì)的形成和功能的發(fā)揮。但BMSCs的抗原表型不具有特異性，在肌肉細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面均可找到同類抗原。有研究顯示BMSCs在傳代培養(yǎng)時保持著細(xì)胞的端?；钚院腿旧w核型［3］，表現(xiàn)出高度擴增能力。BMSCs在形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為梭形、多角形和紡錘形，包括體積較大的成熟細(xì)胞，體積較小的無顆粒細(xì)胞和顆粒細(xì)胞共三個細(xì)胞亞群。

1.2 BMSCs的分化潛能:有學(xué)者認(rèn)為BMSCs最重要的生物學(xué)特性是多向分化潛能，大量體外實驗表明BMSCs可分化為骨、骨髓基質(zhì)、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶和脂肪等多種間充質(zhì)組織［4］。Kadiyala等［5］將BMSCs在體外擴增后置于羥基磷灰石上培養(yǎng)，細(xì)胞產(chǎn)生骨基質(zhì)并向骨細(xì)胞分化。有研究證實BMSCs還具有向心肌細(xì)胞及神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的潛能。Tomita等［6］向低溫造成心肌梗死的動物模型的心肌瘢痕組織中注射大鼠骨髓細(xì)胞，移植細(xì)胞在5 w后分化出了肌管，并且表達了肌球蛋白重鏈和肌鈣蛋白，提示BMSCs已向心肌細(xì)胞分化。更為重要的是在移植細(xì)胞和宿主細(xì)胞間存在間隙連接蛋白connexin－43，表明二者間有縫隙連接形成［7］，這一結(jié)構(gòu)證明BMSCs具有依賴環(huán)境的定向分化能力。細(xì)胞周期研究顯示，大多數(shù)BMSCs處于G0/G1期(約90%)，只有少數(shù)細(xì)胞正在活躍地復(fù)制，高比例的G0/G1期細(xì)胞暗示BMSCs具有高度分化潛能。

2 BMSCs的分離和培養(yǎng)

BMSCs最易從骨髓中分離獲取，但其含量不高，在全骨髓中的比例約為1∶1×105，且細(xì)胞數(shù)量隨體質(zhì)的衰弱或年齡的增加而逐漸減少［8］。因此，在離體條件下將 BMSCs進行分離、純化和擴增十分重要。篩選BMSCs的方法在Friedemtein法基礎(chǔ)上經(jīng)過改良，主要有3種方式:①貼壁篩選法:利用造血細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中呈懸浮生長而BMSCs呈貼壁生長的特性，即底物黏附特性將二者分離。②密度梯度離心法:利用BMSCs與其他細(xì)胞的密度差異，采用Fieoll液或Pereoll液將其分離出來。③免疫學(xué)分離法:采用免疫磁珠法或流式細(xì)胞儀法，依據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物和細(xì)胞特性進行篩選。

培養(yǎng)BMSCs最常用的是DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)培養(yǎng)基(含有10% ～20%的胎牛血清 FBS，100 U/ml鏈霉素，100 U/ml青霉素)。Lennon 等［9］發(fā)現(xiàn)適量的胎牛血清有利于維持BMSCs的貼壁、擴增及多系分化潛能，10%的胎牛血清最有利于BMSCs的培養(yǎng)，濃度過高時容易使細(xì)胞過早老化。培養(yǎng)所采用的細(xì)胞密度一般為5×105/ml。BMSCs可以反復(fù)傳代，傳代細(xì)胞能保持多向分化潛能，不發(fā)生自然分化，傳代后的BMSCs細(xì)胞純度可達到95%［10］。有學(xué)者嘗試用新的方法來分離培養(yǎng) BMSCs，Encina等［11］用抗STRO－1包被的免疫磁珠從人的骨髓基質(zhì)中分離培養(yǎng)BMSCs，其中98%的細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞。Oreffo等［12］采用Hop－26選擇性分離培養(yǎng)人骨髓基質(zhì)細(xì)胞，在Hop－26陽性細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大量呈典型成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞克隆。

3 BMSCs的成骨誘導(dǎo)

自BMSCs被發(fā)現(xiàn)起，多數(shù)都是對其向骨組織分化的研究，決定BMSCs分化方向的關(guān)鍵則是誘導(dǎo)分化的條件［13］。刺激 BMSCs向成骨細(xì)胞分化的物質(zhì)有許多［14－15］，如 TGF－β、BMP、IGF－1等。目前BMSCs成骨定向誘導(dǎo)分化的方法有以下幾種:

①化學(xué)誘導(dǎo):是目前最常用方法，經(jīng)典培養(yǎng)體系中含地塞米松、β－甘油磷酸鈉和抗壞血酸，可誘導(dǎo)人BMSCs定向分化為典型成骨細(xì)胞，此種細(xì)胞堿性磷酸酶活性較高，能產(chǎn)生I型膠原，分泌骨連接素和骨橋素。地塞米松可刺激堿性磷酸酶活性，誘導(dǎo)成骨分化［16］。Ogston等［17］發(fā)現(xiàn)地塞米松濃度在10－8mol/L這一濃度級別具有較高的成骨誘導(dǎo)效率。β－甘油磷酸鈉可為成骨細(xì)胞提供磷離子，促進鈣鹽沉積?？箟难崮艽龠M膠原合成，刺激堿性磷酸酶和ATP酶活性。

②中藥誘導(dǎo):淫羊藿、柚皮苷、黃芪、龜甲等可單獨或與化學(xué)培養(yǎng)液共同發(fā)揮作用誘導(dǎo)BMSCs分化為成骨細(xì)胞。

③成骨細(xì)胞誘導(dǎo):通過成骨細(xì)胞與BMSCs共同培養(yǎng)，以直接接觸的方式調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞融合和增殖，實現(xiàn)成骨誘導(dǎo)。

④物理誘導(dǎo):采用電磁場、體外沖擊波等物理機械刺激，通過MAPK通路使BMSCs向成骨細(xì)胞分化。Wang等［18］發(fā)現(xiàn)低能量沖擊波可激活BMSCs內(nèi)網(wǎng)狀激活系統(tǒng)，誘導(dǎo)TGF－β1的產(chǎn)生，最終誘導(dǎo)骨小結(jié)形成。Takahashi［19］發(fā)現(xiàn)沖擊波作用可促使成骨細(xì)胞表達細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的相關(guān)基因，這種蛋白對于促進成骨起重要作用。

⑤轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo):向靶細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入具有成骨作用的基因，該基因在病變區(qū)轉(zhuǎn)錄為mRNA并翻譯為成骨相關(guān)蛋白，誘導(dǎo)自身成骨。

4 BMSCs成骨特性鑒定

目前對于BMSCs成骨特性的鑒定尚無特異性手段，多采用以下方法:①采用光學(xué)顯微鏡進行形態(tài)學(xué)特性觀察或采用掃描電鏡對有載體依附的BMSCs進行細(xì)胞和組織形態(tài)學(xué)觀察;②免疫組化檢測Ⅰ型膠原;③Von Kossa′s礦化結(jié)節(jié)染色;④Gomori鈣－鈷法檢測堿性磷酸酶;⑤原位雜交檢測骨連接素和骨橋素;⑥MTT比色法測定細(xì)胞活性反應(yīng)。

5 問題與展望

盡管BMSCs的相關(guān)研究已進行了幾十年，也取得了一定進展，國外學(xué)者已建立了兔、鼠及人的BMSCs培養(yǎng)體系，并將其成功誘導(dǎo)為多種結(jié)締組織。但BMSCs相關(guān)研究本身還不夠全面和系統(tǒng)，目前仍處于探索階段。據(jù)殷曉雪等［20］研究發(fā)現(xiàn)，人BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)可產(chǎn)生連續(xù)的礦化結(jié)節(jié)，而鼠MSCs在相同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的礦化結(jié)節(jié)呈島狀且不連續(xù)，與未礦化細(xì)胞群間隔分布，提示種屬間的差異在BMSCs的研究中是不容忽視的，也表明從動物實驗過渡到臨床應(yīng)用仍需進一步深入研究。同時，人們對BMSCs的分化機理尚未完全掌握，尤其是BMSCs的定向分化和制備過程不易調(diào)控。此外，對成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的鑒定以及細(xì)胞與支架材料的融合等諸多問題仍有待人們?nèi)ソ鉀Q。

近年來，利用干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化骨組織成為生物研究領(lǐng)域的熱點之一，其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是獲取大量的、活力和功能良好的種子細(xì)胞。實驗表明，骨髓來源的MSCs分裂增殖能力強，分化潛能大，免疫排斥反應(yīng)較弱，取材方便，無倫理問題的限制，且多次傳代后成骨能力不會減弱，因此BMSCs很適合作為骨組織工程的種子細(xì)胞。同時，作為細(xì)胞表型分化尚不成熟的前體干細(xì)胞，BMSCs在同種異體移植后排斥反應(yīng)也比較弱，是一種理想的替代治療的靶細(xì)胞。隨著相關(guān)研究的深入，BMSCs在細(xì)胞替代治療和組織工程中有著廣闊的應(yīng)用前景。

［1］Phinney DG.Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations:clues to their therapeutic efficacy［J］.Cell Cycle，2007，6(23):2884.

［2］欽 斌，蔡建平.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞臨床研究進展［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，6(4):11.

［3］Conget PA，Minguell JJ.Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells［J］.J Cell Physiol，2011，181(1):67.

［4］岑航輝.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究［J］.國外醫(yī)學(xué)輸血及血液學(xué)分冊，2002，25(4):359.

［5］孫曉艷，范洪學(xué).骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進展［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2007，28(2):156.

［6］Tomita S，Li RK，Weisel RD，et al.Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function ［J］.Circulation，1999，100(19Suppl):II247.

［7］Makino S，F(xiàn)ukuda K，M Iyoshi S，et al.Cardio myocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro［J］.J Cli Invest，1999，103(5):697.

［8］David CC，Reiner C，Catla M，et al.Rapid expansion of recycling stems cells in cultures of plastic－adherent cells from human bone marrow［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(7):3213.

［9］Lennon DP，Haynesworth SE，Young RG，et al.A chemically defined medium supports in vitro proliferation mesenchymal stem cells［J］.Exp Cell Res，2009，219(1):211.

［10］殷曉雪，陳仲強，郭昭慶，等.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞及其鑒定［J］.中國修復(fù)重建外科雜志，2004，18(2):88.

［11］Encina NR，Billotte WG，Hofmann MC.Immunomagnetic isolation of osteoprogenitors from human bone marrow stroma［J］.Lab Invest，1999，79(4):449.

［12］Oreffo RO，Virdi AS，Triffitt JT.Retroviral Marking of human bone marrow fibroblasts in vitro expansion and localization in calvarial sites after subcutaneous transplantation in vivo［J］.J Cell Physiol，2001，186(2):201.

［13］Deng W，Obrocka M，F(xiàn)ischer I，et al.In vitro differentiation of human marrow stromal cells into early progenitors of neural cells by conditions that increase intracellular cyclic AMP［J］.Biochem Biophys Res Commun 2001，282(1):148.

［14］Chen M，Qu Q，Shen T，Zhang S，et al.Expression of cell surface antigens during the differentiation of osteoblast by human bone marrow－derived mesenchymal stem cells［J］.Zhongguo Yixue Kexueyuan Xuebao，2007，29(1):62.

［15］Shimizu K，Ito A，Yoshida T，et al.Bone tissue engineering with human mesenchymal stem cell sheets constructed using magnetite nanoparticles and magnetic force［J］.J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2007，82(2):471.

［16］魏寬海，裴國獻，鄭 磊，等.地塞米松對骨髓基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響［J］.中國修復(fù)重建外科雜志，2001，15(4):232.

［17］Ogston N，Harrison AJ，Cheung HF，et al.Dexamethasone and retinoic acid differentially regulate growth and differentiation in an immortalised human clonal bone marrow stromal cell line with osteoblastic characteristics［J］.Steroids，2002，67(11):895.

［18］Wang CJ，Wang FS，Yang KD，et al.Shock wave therapy induces neovascularization at the tendon－bone junction.A study in rabbits［J］.J Orthop Res，2003，21(6):984.

［19］Takahashi K，Yamazaki M，Saisu T，et al.Gene expression for extracellular matrix proteins in shockwave－induced osteogenesis in rats［J］.Calcif Tissue Int，2004，74(2):187.

［20］殷曉雪，陳仲強，郭昭慶，等.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞及其鑒定［J］.中國修復(fù)重建外科雜志，2004，18(2):88.