袁建豐，李林林，孫敏華，董嘉文，胡奇林

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，廣東廣州 510640；2.廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640）

病原微生物的致病作用是由多種蛋白質(zhì)共同參與下的病原微生物-宿主相互作用的復(fù)雜過(guò)程，因此應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法動(dòng)態(tài)、整體和定量地分析病原微生物致病過(guò)程中蛋白質(zhì)的差異表達(dá)譜，對(duì)于解析病原微生物的致病機(jī)制具有至關(guān)重要的作用。相對(duì)和絕對(duì)定量的等量異位標(biāo)簽技術(shù)（Isobaric tags for relativeand absolute quantitation，iTRAQ）以其高通量、重復(fù)性好、能夠處理復(fù)雜樣本和同時(shí)進(jìn)行定性、定量分析的優(yōu)點(diǎn)，在生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。

隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成，生命科學(xué)進(jìn)入后基因組時(shí)代，系統(tǒng)生物學(xué)迅速發(fā)展。蛋白質(zhì)組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)重要的技術(shù)平臺(tái)，蛋白質(zhì)組學(xué)以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，應(yīng)用相關(guān)研究技術(shù)，從整體水平上認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的存在及活動(dòng)方式。它的真正意義在于：不是孤立地研究某種蛋白質(zhì)分子的功能，而是研究某種蛋白質(zhì)在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中的功能，從而能夠揭示蛋白質(zhì)的活動(dòng)規(guī)律，透視生命的本質(zhì)[1-3]。比較蛋白質(zhì)組學(xué)著重于尋找和篩選兩個(gè)或以上樣本之間的差異蛋白質(zhì)譜，揭示細(xì)胞生理和病理狀態(tài)的進(jìn)程與本質(zhì)，同時(shí)獲得對(duì)某些關(guān)鍵蛋白質(zhì)的定性、定量和功能信息，在疾病的早期診斷、病程及環(huán)境因素影響分析等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值[4-6]。它能夠動(dòng)態(tài)、整體和定量地研究病原微生物致病過(guò)程中蛋白質(zhì)種類(lèi)和數(shù)量的改變，并有助于深入研究病原微生物-宿主的相互作用[7-10]。

近年來(lái)，高通量蛋白質(zhì)組學(xué)的儀器、試劑和技術(shù)的出現(xiàn)，使得同時(shí)識(shí)別和比較疾病發(fā)生以及與疾病治療相關(guān)的蛋白表達(dá)水平變化成為可能[11]。iTRAQ技術(shù)是由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI研發(fā)的一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)采用4種或8種同位素編碼的標(biāo)簽，特異性標(biāo)記多肽的氨基基團(tuán)，然后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可以同時(shí)比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量或絕對(duì)含量[12]。目前，iTRAQ標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用。本文就iTRAQ技術(shù)的原理、方法及在微生物比較蛋白質(zhì)組學(xué)中的相關(guān)研究作一綜述，以期為病原微生物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供參考和借鑒。

1 iTRAQ技術(shù)的主要原理

iTRAQ采用4種或8種同位素編碼的標(biāo)簽，可以同時(shí)比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量或絕對(duì)含量。以8種不同的同位素試劑為例，這些試劑由3種不同的化學(xué)標(biāo)簽組成：標(biāo)簽分子分別由質(zhì)量為113、114、115、116、117、118、119和 121的報(bào)道基團(tuán)（Reporter group），質(zhì)量為 192、191、190、189、188、187、186 和184的質(zhì)量平衡基團(tuán)以及一個(gè)相同的氨基酸特異性多肽反應(yīng)基團(tuán)（Amine specific peptide reactive group）組成。多肽反應(yīng)基團(tuán)將iTRAQ標(biāo)簽與肽段的N-端基團(tuán)和每個(gè)賴(lài)氨酸側(cè)鏈相連（因此可標(biāo)記所有酶解肽段），8種報(bào)告基團(tuán)通過(guò)質(zhì)量平衡基團(tuán)與多肽反應(yīng)基團(tuán)相連。由于iTRAQ試劑質(zhì)量是等量的，即不同同位素在標(biāo)記同一多肽后，在第一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)分子量完全相同。用串聯(lián)質(zhì)譜方法對(duì)在第一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)到的前體離子（Precursor ion）進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，產(chǎn)物離子通過(guò)第二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行分析。在二級(jí)質(zhì)譜分析過(guò)程中，報(bào)告基團(tuán)、質(zhì)量平衡基團(tuán)和多肽反應(yīng)基團(tuán)之間的鍵斷裂，質(zhì)量平衡基團(tuán)丟失，產(chǎn)生低質(zhì)荷比（m/z）的報(bào)告離子。由于二級(jí)質(zhì)譜可以分析相對(duì)分子質(zhì)量相差1的報(bào)告基團(tuán)，不同報(bào)告基團(tuán)離子強(qiáng)度的差異就代表了它所標(biāo)記的多肽的相對(duì)豐度。同時(shí)，多肽內(nèi)的酰胺鍵被斷裂，形成一系列b離子和y離子，從而得到離子片段的質(zhì)量數(shù)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)和比較，可以鑒定出相應(yīng)的蛋白質(zhì)前體。通過(guò)在樣本中加入體外合成并且經(jīng)一種iTRAQ標(biāo)記的多肽標(biāo)準(zhǔn)品做內(nèi)標(biāo)，還可以進(jìn)行蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量。

iTRAQ技術(shù)的一般操作流程[13]：樣品先經(jīng)胰蛋白酶裂解、烷基化、酶解為肽段，所產(chǎn)生的肽段用iTRAQ試劑多重標(biāo)簽進(jìn)行差異標(biāo)記，再將標(biāo)記樣本相混合，最后進(jìn)行LC-MS/MS分析。每一個(gè)iTRAQ實(shí)驗(yàn)都會(huì)產(chǎn)生成千上萬(wàn)個(gè)光譜，數(shù)千個(gè)可識(shí)別多肽和上百個(gè)可鑒定蛋白，因此生物信息學(xué)工具和分析方法對(duì)于分析和解釋這些數(shù)據(jù)是必不可少的。許多新近開(kāi)發(fā)的數(shù)據(jù)管理和分析工具可以用來(lái)分析這些龐大的數(shù)據(jù)，如ProQuant、ProteinPilot等。

2 iTRAQ技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

iTRAQ技術(shù)作為一種新的、能夠進(jìn)行絕對(duì)和相對(duì)定量的技術(shù)，具有良好的精確性和可重復(fù)性，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)技術(shù)的不足，其優(yōu)點(diǎn)為：（1）可以同時(shí)對(duì)多種不同樣本中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量比較，因此可以對(duì)正常與疾病、治療前后、疾病發(fā)展過(guò)程、細(xì)胞培養(yǎng)的不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)和量的變化進(jìn)行研究[2]；（2）由于iTRAQ試劑可以對(duì)每個(gè)蛋白的多個(gè)氨基及側(cè)鏈氨基酸進(jìn)行標(biāo)記，因此幾乎樣本中的所有蛋白均可以標(biāo)記，而且可以對(duì)膜蛋白、疏水蛋白等DIGE技術(shù)不能檢測(cè)的蛋白進(jìn)行標(biāo)記[3]；（3）iTRAQ試劑可以標(biāo)記修飾后的氨基酸，因此可以對(duì)磷酸化蛋白、糖基化蛋白等翻譯后修飾（Posttranslational modifications，PTMs）蛋白進(jìn)行定量和定性研究[6]；（4）iTRAQ試劑的報(bào)告離子為小分子物質(zhì)，因此在質(zhì)譜圖中很容易與其它多肽片段離子區(qū)分，保證了定量的準(zhǔn)確性[12-13]。目前，iTRAQ標(biāo)記技術(shù)已成為研究蛋白質(zhì)組學(xué)的有效工具。

和其它蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)一樣，結(jié)合多維液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜的iTR AQ標(biāo)記技術(shù)也有自己的局限性：對(duì)全蛋白質(zhì)組而言，它只能對(duì)相對(duì)豐度進(jìn)行比較，因此只能提供相對(duì)的定量；數(shù)據(jù)的復(fù)雜度更高，因此需要開(kāi)發(fā)更多的信息學(xué)工具；高豐度蛋白質(zhì)干擾了低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)和鑒定；每次試驗(yàn)研究人員都必須鑒別全部的蛋白質(zhì)組；i-TRAQ試劑幾乎可以與樣本中的所有蛋白結(jié)合，容易受樣本中的雜質(zhì)蛋白及樣本處理過(guò)程中緩沖液的污染，需要對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理并盡量減少操作過(guò)程中的污染；iTRAQ試劑仍非常昂貴，這也一定程度制約了它的廣泛應(yīng)用。

3 iTRAQ技術(shù)在微生物比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用

iTRAQ技術(shù)自2004年推出以來(lái)，已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的許多領(lǐng)域，包括標(biāo)記蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及翻譯后修飾研究、時(shí)程變化分析、基因與蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)分析、細(xì)胞膜與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析和藥物靶點(diǎn)分析等。病原微生物的致病作用是多種蛋白質(zhì)共同參與下的病原微生物-宿主相互作用的復(fù)雜過(guò)程，因此運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法動(dòng)態(tài)、整體和定量地分析病原微生物致病過(guò)程中蛋白質(zhì)的差異表達(dá)譜，對(duì)于解析病原微生物的致病機(jī)制，探討病原微生物與宿主的互作，并從中尋找新的、潛在的藥物靶標(biāo)和疫苗靶分子具有至關(guān)重要的作用。

Ross等于2004年率先用iTRAQ-MS/MS技術(shù)比較了野生型啤酒酵母和兩種基因缺陷型突變體的蛋白質(zhì)組，證明該技術(shù)不僅可以提高蛋白質(zhì)組表達(dá)差異分析的覆蓋率，而且可以改善肽鏈斷裂模式，在加入體外合成且經(jīng)一種iTRAQ標(biāo)記的多肽標(biāo)準(zhǔn)品后[14]，還可以進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。Aggarwal等采用iTRAQ-MS/MS方法研究rhsA元件表達(dá)存在不同的大腸桿菌蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)譜，找到了5 068個(gè)來(lái)自780種蛋白質(zhì)表達(dá)有差異的多肽，其中包括一些轉(zhuǎn)錄因子等低豐度蛋白質(zhì)，65%以上的蛋白質(zhì)有2個(gè)以上的高可信度多肽與之匹配[15]。Li等用LC-MALDI MS Shotgun方法分析了白斑綜合癥病毒（WSSV）的蛋白質(zhì)組，共鑒定出45個(gè)病毒蛋白，其中13個(gè)為首次報(bào)道，7個(gè)蛋白的N末端被乙酰化。在此基礎(chǔ)上，作者利用iTRAQ技術(shù)鑒別病毒的包膜蛋白和核衣殼蛋白，共鑒定出23個(gè)包膜蛋白和6個(gè)核衣殼蛋白，從而表明iTRAQ技術(shù)能高通量地鑒別病毒蛋白質(zhì)的分布[16]。Eshghi等利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體Copenhageni血清型在體外傳統(tǒng)培養(yǎng)條件和模擬體內(nèi)培養(yǎng)條件（限制鐵離子濃度和加入血清）下的總蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比較分析，共鑒定出563個(gè)蛋白質(zhì)，其中65個(gè)蛋白質(zhì)呈差異表達(dá)，包括問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體的毒力因子Loa22和5個(gè)新發(fā)現(xiàn)的、與其它病原菌毒力因子同源的蛋白質(zhì)，從而提示我們比較分析模擬體內(nèi)感染條件下蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)譜可以為鑒定病原菌新的、潛在的毒力因子提供一種快捷的、高通量的技術(shù)方法[17]。前期研究表明乙型肝病毒（HBV）能夠調(diào)控肝臟血管生成（Angiogenesis），但其調(diào)控機(jī)制仍然未知。Zhang等將具有感染性的HBV病毒基因組轉(zhuǎn)染于RPHs和HepG2細(xì)胞中，利用iTRAQ定量蛋白技術(shù)分析RPHs和HepG2細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組，結(jié)果顯示iTRAQ技術(shù)能夠有效地評(píng)估肝臟血管生成中HBV病毒的復(fù)制，鑒定出的血管生成相關(guān)蛋白可以作為抗肝細(xì)胞癌治療以及診斷方法的靶標(biāo)分子[18]。早期診斷對(duì)于治療HBV引起的急性肝病起著至關(guān)重要的作用，F(xiàn)eng等利用iTRAQ技術(shù)分析了前期實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染了HBV A/B/C基因組的HepG2細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組，結(jié)果表明共鑒定出32個(gè)特有的蛋白質(zhì)，與空白組相比，大多數(shù)蛋白質(zhì)呈下調(diào)表達(dá)[19]。Carranz等利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，研究了蘇黎世克洛諾斯氏菌（C.turicensis）對(duì)熱應(yīng)激和冷應(yīng)激適應(yīng)的分子機(jī)制，結(jié)果表明細(xì)菌在47℃生長(zhǎng)時(shí)約有20%被鑒定的蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)生了改變[20]。值得關(guān)注的是，在細(xì)菌熱應(yīng)激時(shí)許多毒力因子呈上調(diào)表達(dá)，從而提示細(xì)菌在該生長(zhǎng)條件下具有潛在的致病性。Battchikova等應(yīng)用鳥(niǎo)槍法蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，分析了藍(lán)細(xì)菌在低二氧化碳環(huán)境中蛋白質(zhì)組的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明19%的蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)生了改變，占藍(lán)細(xì)菌理論ORFs的17%，其中76個(gè)蛋白質(zhì)呈明顯的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)[21]。為了研究卡泊芬凈（Caspofungin）對(duì)煙曲霉（A.fumigatus）藥物作用潛在的生物標(biāo)記，Cagas等用iTRAQ技術(shù)比較了藥物作用前后煙曲霉蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，結(jié)果顯示在可溶性和細(xì)胞壁/細(xì)胞質(zhì)膜的蛋白質(zhì)中有471個(gè)蛋白呈特異性表達(dá)[22]。此外，總計(jì)有122個(gè)蛋白的差異表達(dá)水平至少超過(guò)2倍，其中線粒體缺氧反應(yīng)蛋白的差異表達(dá)水平達(dá)16倍以上。Sivagnanam等通過(guò)iTRAQ，比較了以葡萄糖和木糖為不同發(fā)酵底物時(shí)丙酮丁醇梭桿菌（C.acetobutylicum）的蛋白質(zhì)組，共鑒定出894個(gè)蛋白質(zhì)，689個(gè)為兩種底物所共有，22個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)出明顯的差異，結(jié)果顯示以葡萄糖為發(fā)酵底物時(shí)鞭毛相關(guān)蛋白呈上調(diào)表達(dá)，而在以木糖為發(fā)酵底物時(shí)，由于CheW和CheV的缺乏，丙酮丁醇梭桿菌的趨化活性喪失[23]。伯氏疏螺旋體（B.burgdorferi）為引起萊姆病的病原體，研究表明伯氏疏螺旋體hrpA基因的缺失能夠?qū)е缕淝秩拘∈蟮哪芰ν耆珕适Аalman-Dilgimen等利用iTRAQ技術(shù)比較了hrpA基因野生型和突變型菌株的蛋白質(zhì)組，共鑒定出187個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，結(jié)果提示hrpA基因可能是B.burgdorfer基因表達(dá)調(diào)控中的一種新的、遠(yuǎn)距離全局調(diào)控通路的一部分，并且首次報(bào)道了RNA螺旋酶是細(xì)菌基因表達(dá)全局調(diào)控途徑中的調(diào)控元件，再次驗(yàn)證了RNAs參與細(xì)菌基因的表達(dá)調(diào)控這一最新觀點(diǎn)[24]。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）優(yōu)先感染肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）并且在其中復(fù)制，為了探尋感染病毒后PAMs細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)的差異，Lu等利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了PRRSV感染和對(duì)照細(xì)胞之間蛋白質(zhì)組的差異，結(jié)果表明差異蛋白主要與病毒結(jié)合、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞吸附等細(xì)胞功能相關(guān)，從而提示我們感染PRRSV的PAMs蛋白質(zhì)表達(dá)譜有助于更深入地理解PRRSV的復(fù)制機(jī)制、致病機(jī)理以及與宿主細(xì)胞之間的相互作用[25]。

4 展 望

比較蛋白質(zhì)組學(xué)是當(dāng)今蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)重要領(lǐng)域，比較不同生理和病理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)和蛋白質(zhì)修飾，對(duì)于揭示生物系統(tǒng)復(fù)雜的生理和病理過(guò)程具有十分重要的意義。比較蛋白質(zhì)組學(xué)著重于尋找和篩選兩個(gè)或以上樣本之間的差異蛋白質(zhì)譜，揭示細(xì)胞生理和病理狀態(tài)的進(jìn)程與本質(zhì)，同時(shí)獲得對(duì)某些關(guān)鍵蛋白的定性、定量和功能信息。迄今為止，大多蛋白質(zhì)組方法只能進(jìn)行兩個(gè)蛋白質(zhì)樣品的同步比較，如2-DE、DIGE等。目前只有iTRAQ技術(shù)能夠同時(shí)進(jìn)行8個(gè)樣品的標(biāo)記和同步比較分析。盡管iTRAQ技術(shù)還存在一些缺點(diǎn)和不足，但該技術(shù)在比較蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用價(jià)值已得到驗(yàn)證?？梢灶A(yù)見(jiàn)，iTRAQ標(biāo)記技術(shù)將會(huì)成為微生物比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)手段，從而為解析病原微生物的致病機(jī)制，探討病原微生物與宿主的互作，并從中尋找新的、潛在的藥物靶標(biāo)和疫苗靶分子作出積極的貢獻(xiàn)。

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