顧貴洲，張 強，劉春爽，胡恒宇，趙東風(fēng)

（1．中國石油大學(xué)（華東）化學(xué)工程學(xué)院，山東 青島266555；2．遼寧石油化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，遼寧 撫順113001）

經(jīng)歷二次和三次采油之后，許多老油氣田面臨廢棄，尤其是一些稠油甚至超稠油油田，無論技術(shù)如何更新，仍有50%以上的原油無法回收，而油田一旦廢棄，這些儲量將永遠失去［1］。殘余低品位稠油微生物氣化技術(shù)是近幾年來國際上正在探索的延長油藏開發(fā)壽命的新技術(shù)，它是利用產(chǎn)甲烷微生物菌群在厭氧環(huán)境下將殘余稠油轉(zhuǎn)化為天然氣，然后以天然氣形式開采或作為戰(zhàn)略性資源就地儲備［2］。作為國內(nèi)外研究熱點，石油烴生物氣化的可行性已經(jīng)在實驗室條件下得到證實［3－5］。研究表明［6－9］，原 油 厭 氧 降 解 產(chǎn) 甲 烷 過 程 需 要由不同功能菌群共同參與、協(xié)同作用才能完成，這種協(xié)同作用主要分為2個階段：（1）降解階段，即石油烴降解為小分子有機物；（2）產(chǎn)氣階段，即小分子物質(zhì)最終轉(zhuǎn)化成甲烷等氣體。雖然國內(nèi)外對石油烴厭氧降解產(chǎn)甲烷研究較多［10－12］，但原油氣化開采一般針對經(jīng)歷過三采后的老油田，油品更稠、膠質(zhì)與瀝青質(zhì)含量更高，開采難度更大，因而目前國際上以稠油為氣化對象的還比較少。因此，富集獲得高效稠油降解產(chǎn)甲烷混合菌群是殘余低品位稠油微生物氣化技術(shù)的關(guān)鍵。

作者從勝利油田某區(qū)塊油井采出水中篩選獲得一組高效稠油降解產(chǎn)甲烷混合菌群，考察混合菌群的組成，并探討其產(chǎn)甲烷特性，以期為殘余低品位稠油微生物氣化奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1．1 樣品來源、儀器與培養(yǎng)基

實驗樣品來源于勝利油田某區(qū)塊油井采出水，該區(qū)塊地質(zhì)信息見表1。采出液通過采樣井的井口閥門收集到10L采樣桶中，待采樣桶完全被油水混合物充滿后，密封，快速送回實驗室4℃下保存。

通用突變檢測系統(tǒng)，美國DCode；凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂；Allegra 25R型高速冷凍離心機，美國Beckman；GC－3800型氣相色譜儀，美國 Varian；OIL－510型全自動紅外分光測油儀，北京華夏科創(chuàng)儀器技術(shù)有限公司。

無機鹽培養(yǎng)基（g）：K2HPO45．0，KH2PO45．0，NH4Cl 5．0，NaCl 10，MgCl22．0，CaCl20．1，H2O 1000mL，pH值7．0～7．5。

1．2 混合菌群的富集

以油田采出水為接種物富集培養(yǎng)，接種量按20%（體積分數(shù)）接種到厭氧瓶中，加入2mL原油，每個樣品設(shè)置3個平行實驗，于55℃生化培養(yǎng)箱暗室培養(yǎng)380d。

表1采樣區(qū)塊地質(zhì)信息Tab．1 Geological information of sampling block

1．3 單菌株分離

運用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)［13，14］對混合菌群進行單菌株分離。具體方法為：在無機鹽培養(yǎng)基中補加2%瓊脂粉，分裝于厭氧試管（4．5mL培養(yǎng)基／管），滅菌。置厭氧試管于沸水浴至瓊脂完全熔化。轉(zhuǎn)到55℃的水浴鍋中，補加Na2S·9H2O至終濃度為0．03%（質(zhì)量濃度）；補加 NaHCO3至終濃度為0．2%（質(zhì)量濃度）。滾管，將滾好的所有厭氧試管靜置2h以上，使培養(yǎng)基表面的液體被充分吸收。接種后于55℃暗箱培養(yǎng)。

1．4 菌群結(jié)構(gòu)分析

使用Tiangen細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取混合菌群總DNA。以細菌16SrDNA V3 區(qū) 的 引 物 341F （5′－CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG－3′）和 534R （5′－ATTACCGCGGCTGCTGG－3′）對 提 取 的 DNA 進 行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。以Biorad Dcode系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進行DGGE分析，聚丙烯酰胺膠質(zhì)量濃度為8%，變性劑濃度梯度為40%～60%。電泳完畢后，將膠置于含1mg·L－1EB的1×TAE緩沖溶液中染色，將染色后的凝膠用凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖像。將待測序條帶切下，按前述PCR體系與條件進行擴增，送上海生工生物工程公司純化測序，測序結(jié)果輸入GenBank進行比對分析。

1．5 甲烷含量測定

用氣相色譜儀測定富集厭氧瓶頂空氣體中甲烷含量。進樣體積為0．5mL，采用面積歸一法定量。色譜條件如下：Al2O3色譜柱（50m×0．53mm×20μm）；柱溫從40℃開始，2min升至100℃，再以10℃·min－1的速率升至170℃，保持25min；進樣口溫度為100℃；FID檢測器溫度為150℃，載氣為高純氦氣。

1．6 含油量測定

用全自動紅外分光測油儀測定含油量。將《水質(zhì)、石油類和動植物油的測定－紅外光度法》（GB／T 16488－1996）稍作改進。培養(yǎng)基中的原油經(jīng)混合菌降解后變?yōu)槲⑿⌒躞w，萃取液通過鋪有無水Na2SO4的玻璃砂芯漏斗脫水時極易堵塞，因此采用循環(huán)水式真空泵將萃取液抽入抽濾瓶中。同時，為了保證脫水效果，將無水Na2SO4的厚度由標(biāo)準(zhǔn)中的10mm增至15 mm。

2 結(jié)果與討論

2．1 稠油降解產(chǎn)甲烷菌群的組成

勝利油田某區(qū)塊油井采出水在55℃下經(jīng)過380d富集培養(yǎng)，獲得一組稠油降解產(chǎn)甲烷混合菌群，命名為SL－7。通過亨蓋特厭氧滾管技術(shù)從該菌群中分離獲得2株可分離培養(yǎng)單菌，分別記為SL－7－1、SL－7－2。分別提取混合菌群SL－7與2株單菌的DNA同時進行DGGE分析，比較單菌在混合菌群中的位置，結(jié)果見圖1。

圖1 混合菌群SL－7與單菌株的DGGE圖譜Fig．1 The DGGE analysis of the microbial consortium SL－7and two single strains

由圖1可知，混合菌群SL－7由6個主要的單菌株組成，并且2株降解單菌條帶均能與SL－7中的條帶相對應(yīng)，SL－7－1對應(yīng)Band 1，SL－7－2對應(yīng) Band 2。對主要條帶進行測序分析，確定了這些菌株的可能分類，結(jié)果見表2。

表2混合菌群SL－7DGGE條帶序列分析Tab．2 Sequence analysis of the microbial consortium SL－7from dominant DGGE bands

PCR－DGGE技術(shù)可以直觀地反映微生物的群落結(jié)構(gòu)［15］，檢測到不易分離培養(yǎng)的優(yōu)勢菌株，揭示混合菌群的結(jié)構(gòu)組成。由表2可知，混合菌群SL－7包含4株不可培養(yǎng)細菌（Band 3、Band 4、Band 5、Band 6）和2株已分離獲得的降解單菌（Band 1、Band 2）。單菌株SL－7－1與來自Firmiucutes（厚壁菌門）的Clostridium sp．XB90同源性為98%。研究表明，該類細菌能夠厭氧降解烴類化合物或者利用烴降解的中間產(chǎn)物產(chǎn)生甲烷菌可以利用的前體物質(zhì)［16］。單菌株SL－7－2與來自β－Proteobacteria（β－變性菌門）的 Achromobacter sp．BPZ11同源性為97%。

SL－7對稠油的降解可能是微生物降解和其中多株單菌共同代謝、共同作用的結(jié)果。油田采出水中存在著經(jīng)自然選擇優(yōu)化過的混合菌群，其中不同菌株的功能和作用通過長期的演化穩(wěn)定下來，在混合菌群SL－7中形成了一種較為穩(wěn)定的細菌群落結(jié)構(gòu)，一些不可分離培養(yǎng)的菌株（如Band 3、Band 4、Band 5、Band 6所代表的菌株）可能對稠油的降解起著重要的作用，但在目前培養(yǎng)條件下無法分離得到。因此，直接利用混合菌群來降解稠油，可以避免這些無法分離培養(yǎng)的關(guān)鍵菌株的丟失［17］?；旌暇篠L－7將稠油中難以直接利用的大分子烴類降解為小分子烴類物質(zhì)，完成稠油厭氧降解產(chǎn)甲烷的第一個階段，為下一步產(chǎn)氣階段做準(zhǔn)備。

2．2 稠油降解產(chǎn)甲烷菌群的產(chǎn)甲烷特性

采用氣相色譜法測定富集厭氧瓶頂空氣體，以面積歸一法定量，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，55℃下，混合菌群SL－7在380d的培養(yǎng)過程產(chǎn)生大量的甲烷氣體。培養(yǎng)30d時就有少量的甲烷氣體產(chǎn)生，隨著培養(yǎng)時間的延長，甲烷產(chǎn)生量逐漸增加，培養(yǎng)270d時甲烷產(chǎn)生量達到最大值，為1110μmol，之后甲烷產(chǎn)生量保持相對穩(wěn)定?；旌暇篠L－7的產(chǎn)甲烷規(guī)律與微生物的生長周期相關(guān)，符合其生長代謝規(guī)律。

圖2 混合菌群SL－7的產(chǎn)甲烷量Fig．2 Methane production of the microbial consortium SL－7

混合菌群SL－7培養(yǎng)270d所產(chǎn)混合氣的氣相色譜見圖3。

圖3 混合菌群SL－7培養(yǎng)270d所產(chǎn)混合氣Fig．3 Mixed gas produced by microbial consortium SL－7cultured for 270d

由圖3可知，混合菌群SL－7在富集培養(yǎng)270d后生成的有機氣體中，甲烷含量最高，占95．2%；檢測到的其它氣體有異丁烷、正戊烷、2，2－二甲基丁烷、2－甲基戊烷等，共占4．8%；此時混合菌群SL－7對稠油的降解率達到30．6%。

3 結(jié)論

（1）勝利油田某區(qū)塊油井采出水在55℃下經(jīng)過380d富集培養(yǎng)獲得一組稠油降解產(chǎn)甲烷混合菌群SL－7，經(jīng)過DGGE分析發(fā)現(xiàn)，該菌群由6株主要的單菌組成，其中2株單菌可分離培養(yǎng)，分別來自Firmiucutes（厚壁菌門）和β－Proteobacteria（β－變性菌門），另外4株單菌為不可分離培養(yǎng)的菌株。

（2）混合菌群SL－7經(jīng)過270d培養(yǎng)，甲烷產(chǎn)生量達到最大值，為1110μmol；所產(chǎn)有機氣體中甲烷含量最高，占95．2%，其它氣體（異丁烷、正戊烷、2，2－二甲基丁烷、2－甲基戊烷等）占4．8%；此時混合菌群SL－7對稠油的降解率達到30．6%。

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