姚小飛，吳曉慧，葉 璐

（1．武漢生物工程學(xué)院生物工程系，湖北 武漢430415；2．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢430205；3．武漢市漢鐵高級(jí)中學(xué)，湖北 武漢430010）

目前，發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)酒精的菌種主要以酵母菌為主。酒精是酵母菌厭氧發(fā)酵的重要產(chǎn)物，而過多的酒精對(duì)酵母菌細(xì)胞本身具有毒害作用，會(huì)影響細(xì)胞膜成分和細(xì)胞代謝。因此，酵母菌的產(chǎn)酒精能力與耐酒精能力是密不可分的。Thomas直接以抑制菌株生長時(shí)的酒精濃度來表達(dá)該菌株的酒精耐受性，并根據(jù)不同酒精濃度耐受性將菌株分為3個(gè)等級(jí)［1］。我國測(cè)定酵母菌耐受酒精濃度的方法基本屬于此種范疇［2，3］。

作者結(jié)合酵母菌產(chǎn)酒精能力的檢測(cè)，利用鑒別性平板技術(shù)更快速地選育優(yōu)良的高酒精耐受性產(chǎn)酒酵母菌，具有生產(chǎn)實(shí)踐意義。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 樣品來源

采集某高粱釀酒廠的大曲酒糟作為實(shí)驗(yàn)樣品。

1．2 培養(yǎng)基

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、蒸餾水1000mL，pH值自然。

YPD固體培養(yǎng)基：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%、瓊脂2%、蒸餾水，pH值自然。

TTC上層培養(yǎng)基［4］：葡萄糖5g，瓊脂15g，TTC 0．5g，蒸餾水1000mL。

TTC下層培養(yǎng)基：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母膏1．5g，磷酸二氫鉀1．0g，硫酸鎂0．4g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH 值5．5～5．7。

1．3 方法

1．3．1 產(chǎn)酒酵母菌的分離

取適量樣品置于PDA液體培養(yǎng)基（添加12%酒精）中，于28℃下富集培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋。分別取10－5、10－6、10－7稀釋度的菌懸液各0．1 mL涂布于TTC下層培養(yǎng)基上，于28℃下恒溫培養(yǎng)24h后，在其上覆蓋一層TTC上層培養(yǎng)基，于28℃保溫培養(yǎng)3h，觀察顯色反應(yīng)。根據(jù)顏色現(xiàn)象選取產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的菌株進(jìn)一步劃線純培養(yǎng)［5］。

1．3．2 產(chǎn)酒酵母菌的酒精發(fā)酵能力檢測(cè)

采用二氧化碳失重法［6，7］測(cè)定酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)酒精能力。利用酒精計(jì)測(cè)定酵母菌發(fā)酵的酒精含量。

1．3．3 產(chǎn)酒酵母菌酒精耐受能力檢測(cè)

向已經(jīng)滅菌的YPD固體培養(yǎng)基中加入不同體積的無水酒精，調(diào)整體積分?jǐn)?shù)分別為12%、14%、16%、18%、19%、20%，將初篩的菌株分別接種至不同酒精體積分?jǐn)?shù)的平板上，標(biāo)記靜置10min后，于28℃下恒溫培養(yǎng)48h。

1．3．4 酵母菌的鑒定

用美藍(lán)對(duì)酵母菌進(jìn)行染色，觀察酵母菌個(gè)體形態(tài)。用測(cè)微尺測(cè)定酵母菌的大小。觀察酵母菌群體在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特征。

分別對(duì)篩選得到的酵母菌進(jìn)行氮源同化試驗(yàn)［8，9］、糖發(fā)酵試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、脂肪水解試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、重氮基藍(lán)B（DBB）試驗(yàn)，對(duì)酵母菌進(jìn)行鑒定。

1．3．5 酵母菌的紫外誘變

參照文獻(xiàn)［10］方法進(jìn)行酵母菌生長曲線的繪制。

分別取生長期的菌液3mL加至9套平皿中，攪拌均勻，在254nm波長下，分別經(jīng)紫外線照射（垂直距離30cm）10s、20s、30s、40s、80s、120s、160s、200s、240s后，取出1mL處理菌液稀釋至10－2，取0．1mL涂于平板上，包扎后置于暗處28℃培養(yǎng)48h。以照射時(shí)間為橫坐標(biāo)、致死率為縱坐標(biāo)繪制酵母菌的生長曲線。

采用致死率為60%～80%的條件進(jìn)行誘變操作，將誘變后的菌液涂布于含20%、21%、22%酒精的YPD固體培養(yǎng)基平板上，于28℃下恒溫培養(yǎng)48～72 h后觀察。

2 結(jié)果與討論

2．1 產(chǎn)酒酵母菌的分離

培養(yǎng)液涂布于TTC顯色平板后，共篩選出26株具有不同產(chǎn)酒精能力的酵母菌。其中12株呈深紅色、9株呈微紅色、5株呈粉紅色，分別編號(hào)后進(jìn)一步劃線分離。

2．2 產(chǎn)酒酵母菌的酒精發(fā)酵能力和酒精耐受能力檢測(cè)

對(duì)初篩得到的12株呈深紅色的酵母菌菌株分別進(jìn)行酒精發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1 初篩菌株的酒精發(fā)酵能力Tab．1 The fermentation ability of the preliminarily－screened strains

由表1可以看出，S5、S9、S13、S15、S16、S17、S24等7株酵母菌的產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)，檢測(cè)這7株酵母菌的酒精耐受能力，結(jié)果見表2。

表2 7株酵母菌的酒精耐受性Tab．2 Alcohol tolerance of the seven yeast strains

由表2可知，隨著酒精體積分?jǐn)?shù)的增大，酵母菌的生長逐漸受到抑制。比較7株菌株，其中僅有菌株S17可以耐受19%的酒精。因此，將菌株S17作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)菌株。

2．3 菌株S17的鑒定

2．3．1 形態(tài)大小觀察

菌株S17的個(gè)體形態(tài)見圖1，菌落形態(tài)見圖2。

由圖1可知，S17營養(yǎng)細(xì)胞呈圓形或橢圓形，繁殖方式主要為芽殖，細(xì)胞大小為（2．1～3．5）μm×（7．1～13）μm。

由圖2a可知，菌株S17的菌落為圓形，大小為4．0～5．5mm，邊緣整齊，有明顯的凸起，菌落呈乳白色，透明度較差，質(zhì)地光滑較濕潤。圖2b為TTC顯色平板上的劃線分離結(jié)果。

2．3．2 生理生化試驗(yàn)

菌株S17的氮源同化及糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果分別見表3、表4，其它生化試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表3 菌株S17對(duì)氮源的同化情況Tab．3 The nitrogen assimilation for strain S17

表4 菌株S17對(duì)糖類的發(fā)酵情況Tab．4The carbohydrate fermentation for strain S17

表5 菌株S17的其它生理生化指標(biāo)Tab．5 The physiological and biochemical characters identification of strain S17

綜合上述形態(tài)觀察和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》，初步確定S17屬于酒香酵母屬（Brettanomyces）。

2．4 菌株S17的紫外誘變

2．4．1 菌株S17的生長曲線

以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD600值為縱坐標(biāo)，繪制菌株S17的生長曲線，結(jié)果如圖3所示。

圖3 菌株S17的生長曲線Fig．3 The growth curve of strain S17

由圖3可知，菌株S17培養(yǎng)至18～20h即到達(dá)穩(wěn)定期。因此，選擇培養(yǎng)20h的酵母菌細(xì)胞作為最佳出發(fā)菌種。

2．4．2 菌株S17的致死曲線

經(jīng)平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算出紫外線照射不同時(shí)間的致死率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 菌株S17的致死曲線Fig．4 The mortality curve of strain S17

由圖4可知，隨著紫外線照射時(shí)間的延長，菌株S17的致死率呈上升的趨勢(shì)。照射時(shí)間為120s時(shí)，致死率就達(dá)到了82%；照射時(shí)間為160s時(shí)，致死率達(dá)到90%。因此，選擇最佳紫外線照射時(shí)間為120s。

2．4．3 正突變株的篩選

將生長期酵母菌懸液經(jīng)紫外線照射120s后，適當(dāng)稀釋涂布于含20%、21%、22%酒精的YPD固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選，結(jié)果在含20%酒精的平板上篩選出一株正突變株，標(biāo)記為酵母菌S－T－01。

3 結(jié)論

從某高粱釀酒廠的酒糟中，通過TTC平板顯色實(shí)驗(yàn)，共篩選到26株具有產(chǎn)酒精能力酵母菌。對(duì)26株酵母菌分別進(jìn)行酒精發(fā)酵能力和酒精耐受能力檢測(cè)，最終獲得一株耐受19%酒精的酵母菌株，編號(hào)為S17。對(duì)菌株S17進(jìn)行形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)，鑒定菌株S17屬于酒香酵母屬（Brettanomyces）。對(duì)菌株S17進(jìn)行紫外誘變以提升其耐酒精的能力。結(jié)果表明，菌株S17經(jīng)紫外線照射120s，篩選到一株可以耐受20%酒精的正突變株，相比原始菌株的酒精耐受力提高了1%。

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