馮曉輝，余遠(yuǎn)迪，任玉鵬，岳 華，張 斌

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）是一種不能運(yùn)動(dòng)的、革蘭陰性短小桿菌，能引起以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主要特征的Gl?sser′s?。?］。H.parasuis引起的感染給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的損失。革蘭陰性菌的脂多糖（LPS）在其致病性中發(fā)揮重要的作用［2-5］。Bouchet B等［6］發(fā)現(xiàn)H.parasuis LPS部分參與了細(xì)菌對(duì)豬腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和豬呼吸道上皮細(xì)胞的黏附作用和誘導(dǎo)IL-6和IL-8釋放［6-7］。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的成分，由類脂A（Lipid A）、核心多糖和O多糖側(cè)鏈組成。Lipid A為構(gòu)成內(nèi)毒素活性的糖質(zhì)，以共價(jià)鍵鏈接在核心多糖上。而核心多糖是研究LPS功能和結(jié)構(gòu)的重要部分。庚糖基轉(zhuǎn)移酶是核心多糖重要的組成成分。庚糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（HepⅠ）、庚糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅱ（HepⅡ）和庚糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅲ（HepⅢ）依次連接到Lipid A和3-脫氧-D-甘露-辛酮糖酸（Kdo）上。在革蘭陰性菌中，庚糖基的缺失使得LPS的糖鏈嚴(yán)重的縮短，對(duì)血清中補(bǔ)體、抗菌肽和有機(jī)溶劑的敏感性上升，對(duì)宿主的致病性、黏附入侵能力等生物學(xué)特性發(fā)生變化。RfaF基因編碼HepⅡ，該蛋白在細(xì)菌LPS的合成中是必不可少的。研究證實(shí)H.parasuisΔRfaF缺失株降低了對(duì)宿主細(xì)胞黏附入侵作用和抗血清中補(bǔ)體殺菌作用［8］。為了進(jìn)一步研究H.parasuis RfaF的特性，本研究用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)RfaF基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，為深入研究RfaF基因的功能和LPS在H.parasuis菌中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體和菌株 H.parasuis SC096株，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)廖明教授饋贈(zèng)；E.coil DH5α和BL21（DE3）工程菌，pET-32a（＋）表達(dá)載體，由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)教研室保存。

1.1.2 主要試劑 TSA（胰蛋白胨大豆瓊脂），LB固體培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），購(gòu)自Sigma公司；新生牛血清（NCS），購(gòu)自浙江天杭生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素（AMP）、IPTG、T4連接酶，r Taq酶，BamHⅠ限制性內(nèi)切酶，XhoⅠ限制性內(nèi)切酶，Maker DL 2 000，Maker DL15 000，DNA膠回收試劑盒，DNA片段純化試劑盒，小量質(zhì)粒提取試劑盒和預(yù)染蛋白Marker，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG（二抗）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗4型副豬嗜血桿菌陽(yáng)性血清（一抗）由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中H.parasuisSH0165菌株（№CP001321）的RfaF基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物。引物如下：P1：5′-CGCGGATCCATGAATATTTTAGTTATTGC -3′， P2： 5′-CCGCTCGAGTTAAAGTGAACTTTTTTTTGA-3′（下劃線部分分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。

1.2.2 RfaF基因的擴(kuò)增 以SC096菌株DNA為模板，用P1／P2引物擴(kuò)增目的片段。反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s，50℃40s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min；16℃1h。PCR產(chǎn)物用膠回收純化試劑盒進(jìn)行純化回收。

1.2.3 RfaF基因的克隆和序列測(cè)定 將純化的PCR產(chǎn)物和pET-32a（＋）載體用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定。陽(yáng)性菌落接種于含AMP（100 μg／mL）的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜，用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。

1.2.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 測(cè)序正確后，命名該重組質(zhì)粒為pET-32a（＋）-RfaF。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單個(gè)菌落并進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.5 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析 將含有pET-32a（＋）-RfaF和pET-32a（＋）空載體的E.coilBL21（DE3）工程菌分別轉(zhuǎn)接于含 AmpP（100 μg／mL）的LB培養(yǎng)基中，200r／min振搖培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1∶100轉(zhuǎn)接于含Amp（100μg／mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD 600nm≈0.6），加入終濃度為1mmol／L的IPTG，分別于誘導(dǎo)后0、2、4、6、12h取菌1mL。菌液經(jīng)12 000r／min離心1min后棄上清，沉淀用100μL pH 7.3的PBS重懸后，煮沸變性5min，10 000r／min離心1min取上清，加入上樣緩沖液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.6 表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析 將優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件后的菌液12 000r／min離心1min后棄上清，沉淀用pH7.3的PBS重懸后用超聲波粉碎儀粉碎30min（工作5s，間隔9s），在4℃以100 00r／min離心15min。分離上清和沉淀，沉淀用pH7.3的PBS重懸，煮沸變性5min，分別取變性后的上清液和重懸后的沉淀，加入上樣緩沖液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.7 表達(dá)蛋白的Western blot分析 將表達(dá)的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，然后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，再轉(zhuǎn)移至封閉液中過(guò)夜，4℃過(guò)夜后，室溫下輕搖2h，用TBST洗膜3次，每次5min。再加入1∶200稀釋的兔抗血清4型H.parasuis陽(yáng)性血清（一抗），室溫下輕搖2h。然后用TBST洗膜3次，每次10min。加入1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（二抗），室溫孵育2h，洗滌方法同上。最后在Versa Doc IMAGING SYSTEM下加顯影液照相觀察。

2 結(jié)果

2.1 RfaF基因的PCR擴(kuò)增

經(jīng)PCR擴(kuò)增的RfaF基因片段經(jīng)10g／L的瓊脂糖凝膠電泳，片段大小約為1 000bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。

圖1 RfaF基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of RfaF gene

2.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定和PCR鑒定

將目的片段克隆到表達(dá)載體pET-32a（＋）中，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，得到一條1 000bp左右的片段和一條5 900bp的片段。結(jié)果表明重組質(zhì)粒與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α后，挑取單菌落經(jīng)PCR擴(kuò)增得到一條1 000bp左右的片段，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by enzyme digestion

2.3 RfaF基因的序列測(cè)定

將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-32a（＋）-RfaF進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)定結(jié)果表明RfaF基因全長(zhǎng)1 053bp，與血清5型分離株SH0165的同源性為96%（GenBank accession№NC-011852），說(shuō)明目的基因已克隆于表達(dá)載體中。

2.4 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析

經(jīng)試驗(yàn)確定1.0mmol／L的IPTG誘導(dǎo)4h時(shí)表達(dá)量最大。表達(dá)產(chǎn)物約為55ku，與預(yù)期蛋白條帶大小相近，而未誘導(dǎo)菌和誘導(dǎo)后的空載體均未出現(xiàn)此蛋白條帶（圖3）。

圖3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.3 Expression of recombinant protein induced by IPTG in E.coli BL21（DE3）

2.5 重組蛋白的可溶性分析

對(duì)超聲波裂解細(xì)菌的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，表明重組蛋白以包涵體的形式存在（圖4）。

圖4 重組蛋白的可溶性分析Fig.4 Solubility analysis of the recombinant protein

2.6 RfaF蛋白的Western blot分析

用兔抗副豬嗜血桿菌4型陽(yáng)性血清（一抗）和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（二抗）對(duì)未純化的包涵體蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果表明原核表達(dá)的RfaF重組蛋白能與副豬嗜血桿菌4型陽(yáng)性血清發(fā)生特異性結(jié)合（圖5中箭頭所指的條帶），RfaF重組蛋白具有良好的抗原性。

圖5 RfaF蛋白的抗原性Western blot分析Fig.5 Antigenicity analysis of RfaF protein by Western blot

3 討論

當(dāng)前國(guó)內(nèi)對(duì)H.parasuis的致病特性還了解的很少。已經(jīng)有報(bào)道表明脂多糖在革蘭陰性菌的致病中發(fā)揮著重要的作用［2-5］，H.parasuisLPS可能在致病中發(fā)揮著重要的作用［9］。在革蘭陰性菌中，LPS內(nèi)部核心結(jié)構(gòu)通常包括3-脫氧-D-甘露-辛酮糖酸（Kdo）和 L-乙酰-D-甘露庚糖（L，D-Hep）［10］。影響Kdo的合成和將Kdo轉(zhuǎn)移到類脂A上的缺失株是致死的，Klena J D等［11］研究表明庚糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅱ的缺失是能實(shí)現(xiàn)的，并能夠使LPS結(jié)構(gòu)有明顯的縮短。為進(jìn)一步研究庚糖在H.parasuis致病性中發(fā)揮的作用，Xu C等［12］構(gòu)建了RfaF基因缺失菌株和互補(bǔ)株。結(jié)果表明，RfaF基因缺失株的LPS結(jié)構(gòu)明顯的縮短，對(duì)血清的抗性有明顯的下降，對(duì)RfaF基因缺失株的黏附入侵能力的研究表明缺失株對(duì)PUVEC和PK15細(xì)胞的黏附入侵能力顯著降低，其互補(bǔ)株的黏附入侵能力恢復(fù)到了野生型水平。

本研究擴(kuò)增并克隆了H.parasuisRfaF基因序列，結(jié)果表明，構(gòu)建的pET-32a（＋）-RfaF／BL21（DE3）系統(tǒng)在IPTG誘導(dǎo)下成功表達(dá)了RfaF蛋白，并對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行了抗原性分析，表明RfaF重組蛋白具有良好的抗原性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究RfaF和脂多糖在H.parasuis致病性中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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