章振華，李 林，沈 佳，景小冬，陳小玲，史愛(ài)華，張建偉，黃鳳軍，姜北宇

（北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京100097）

A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液系用A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株接種適宜培養(yǎng)基，收獲培養(yǎng)液離心后取上清過(guò)濾而成。通常認(rèn)為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液中含有磷酸酯酶C［1-2］，可用其取代價(jià)格昂貴的商品化磷酸酯酶C來(lái)處理雞傳染性支氣管炎病毒（IBV），使該病毒表現(xiàn)出血液凝集（HA）活性，從而制備出IBV血凝抑制試驗(yàn)（HI）抗原［3-5］。IBV HI抗原用來(lái)檢測(cè)雞傳染性支氣管炎（IB）疫苗免疫后雞群的HI抗體水平。目前國(guó)內(nèi)IB滅活疫苗的效價(jià)檢驗(yàn)都用進(jìn)口IBV HI抗原來(lái)測(cè)定，我國(guó)還沒(méi)有商品化的IBV HI抗原。課題組近年來(lái)一直研究如何制備出特異、敏感、穩(wěn)定的IBV HI抗原，而作為制備IBV HI抗原一種重要的原材料，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到IBV HI抗原的質(zhì)量。因此，建立A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于生產(chǎn)出合格的IBV HI抗原產(chǎn)品至關(guān)重要。一般認(rèn)為磷酸酯酶C是使IBV呈現(xiàn)HA活性的酶類(lèi)物質(zhì)，只要測(cè)定A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液中磷酸酯酶C的含量，就能夠確定A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液的準(zhǔn)確加入量，從而建立起可靠的制備IBV HI抗原用A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液中的卵磷脂酶C進(jìn)行含量測(cè)定有兩種方法，一是小鼠致死性試驗(yàn)，由于卵磷脂酶C（α毒素）是A型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的最主要的外毒素［6-8］，其含量的多少與小鼠致死性直接相關(guān)，因此，測(cè)定濾液對(duì)小鼠的最小致死劑量（MLD）可間接反應(yīng)卵磷脂酶C的含量；二是卵磷脂酶活性試驗(yàn)，采用蛋黃瓊脂平板培養(yǎng)基直接測(cè)定A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液中卵磷脂酶C的含量，其原理是卵磷脂酶C在鈣、鎂離子存在的條件下，迅速水解卵黃中的卵磷脂，生成甘油二酸酯和磷酸膽堿；在加有濾液的孔周?chē)a(chǎn)生混濁環(huán)，卵黃被分解產(chǎn)生的游離脂肪和卵黃磷蛋白反應(yīng)而產(chǎn)生沉淀［5，9］。利用卵磷脂的水解試驗(yàn)可證明卵磷脂酶C的存在，以及通過(guò)將濾液作不同稀釋后進(jìn)行測(cè)定，確定濾液中卵磷脂酶C含量。

本研究對(duì)29批次A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液進(jìn)行了小鼠致死性試驗(yàn)、卵磷脂酶活性試驗(yàn)、處理IBV后的其HA活性試驗(yàn)及濾液最小加入量試驗(yàn)，觀(guān)察A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液的小鼠最小致死量、磷酸酯酶C含量與濾液處理過(guò)的濃縮IBV的HA效價(jià)之間的相關(guān)關(guān)系，從而以濾液的小鼠最小致死量或磷酸酯酶C含量為基礎(chǔ)單位確定A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液最佳使用量，以此作為菌濾液質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。如果這兩個(gè)指標(biāo)不能作為濾液的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，可考慮直接以濾液處理IBV后的其HA活性達(dá)到要求的抗原效價(jià)作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)這些試驗(yàn)篩選出一個(gè)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 材料

A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液共29批次，由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物免疫與預(yù)防研究室采用A型產(chǎn)氣莢膜梭菌BZ株接種厭氧肉肝湯培養(yǎng)基或厭氧肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)基制備而成；卵磷脂酶試驗(yàn)培養(yǎng)基按參考文獻(xiàn)［5］方法自制；100倍濃縮IBV M41株病毒液（批號(hào)為20120511），SPF雞血清，IBV陽(yáng)性血清，NDV陽(yáng)性血清，H9亞型禽流感病毒陽(yáng)性血清，HA緩沖液，10mL／L的雞紅細(xì)胞懸液，250g／L的高嶺土懸液，均由本研究室自制。

卵磷脂酶C（批號(hào)061M8623V，125U／瓶），購(gòu)自SIGMA公司；16g～20g昆明雄性小鼠，購(gòu)自軍事科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

A型產(chǎn)氣莢膜梭菌兔陽(yáng)性血清（批號(hào)20090715）及A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單因子血清（批號(hào)20080611），中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所細(xì)菌室蔣玉文研究員惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠致死性試驗(yàn) 先將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液用滅菌生理鹽水作倍比稀釋?zhuān)瑥?∶2稀釋至1∶4或1∶8或1∶16；然后，以A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液原液及不同稀釋度的濾液經(jīng)尾靜脈途徑接種16g～20g的昆明小鼠，每批次濾液原液及不同稀釋度濾液均各接種2只，每只0.2mL，接種后觀(guān)察2d，記錄死亡小鼠數(shù)，測(cè)定相同培養(yǎng)方法制備的不同批次A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液對(duì)小鼠的最小致死量（MLD）。

1.2.2 卵磷脂酶活性試驗(yàn) 先將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液用滅菌生理鹽水作倍比稀釋?zhuān)瑥?∶2稀釋至1∶256；然后，在卵磷脂酶試驗(yàn)培養(yǎng)基上用打孔器（直徑為3mm）打孔，取A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液原液及不同稀釋度的濾液分別加入到培養(yǎng)基相應(yīng)孔中，每孔加0.25mL，加完后放37℃溫箱孵育，觀(guān)察72h，以出現(xiàn)卵磷脂水解而孔周?chē)纬苫鞚岘h(huán)的濾液最高稀釋倍數(shù)作為判定終點(diǎn)。

1.2.3 處理后IBV的HA活性試驗(yàn) 分別取不同批次的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液0.05mL加入到0.45mL 100倍濃縮的IBV M41株病毒液中，充分混勻，放37℃恒溫振蕩器感作2h，取出置2℃～8℃條件下48h，測(cè)定其HA效價(jià)。

1.2.4 制備IBV HI抗原的濾液最小加入量 從被檢29批次A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液中選出10批次，分別以20%、10%、5%、2.5%、1.25%的量加入到100倍濃縮的IBV M41株病毒液中，充分混勻，放37℃恒溫振蕩器感作2h，取出置2℃～8℃條件下48h，測(cè)定其HA效價(jià)；觀(guān)察A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液的加入量與IBV M41株抗原血凝價(jià)的關(guān)系。

1.2.5 商品化卵磷脂酶C處理后IBV的HA活性試驗(yàn) 將商品化卵磷脂酶C用HA緩沖液配制0.125U／mL～4U／mL的溶液，以不同酶含量加入到IBV濃縮病毒液中，加完后充分混勻，放37℃恒溫振蕩器感作2h，取出置2℃～8℃條件下48h，測(cè)定其HA效價(jià)。

1.2.6 卵磷脂酶C處理IBV獲得血凝活性的試驗(yàn)試驗(yàn)分為3組，第1組用A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液和A型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗血清等量混合，第2組用A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液和產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單因子血清等量混合，第3組用A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液和HA緩沖液等容量混合。將上述3組混合樣品在37℃條件下中和50min；分別將上述中和樣品用滅菌生理鹽水作倍比稀釋?zhuān)瑥?∶2稀釋至1∶256，取中和樣品原液及不同稀釋度的中和樣品分別加入到卵黃瓊脂平板培養(yǎng)基相應(yīng)孔內(nèi)，觀(guān)察卵磷脂酶效價(jià)，進(jìn)行卵磷脂酶活性試驗(yàn)；然后，每組各取0.4mL濃縮IBV分別與0.1mL的1組～3組中和樣品進(jìn)行混合，制備IBV HI抗原，同時(shí)，設(shè)1個(gè)對(duì)照組（第4組）將0.4mL濃縮IBV與0.1mL HA緩沖液混合，進(jìn)行處理濃縮IBV HA活性試驗(yàn)，通過(guò)試驗(yàn)觀(guān)察卵磷脂酶C在使IBV獲得血凝活性中所起的作用。

2 結(jié)果

2.1 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液小鼠最小致死量、卵磷脂酶效價(jià)、處理IBV后其HA效價(jià)試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)29個(gè)批次的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液進(jìn)行了小鼠致死活性試驗(yàn)、卵磷脂酶活性試驗(yàn)、處理后IBV的HA活性試驗(yàn)。從表1試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，不同批次的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液對(duì)小鼠致死活性存在較大差異，從原液0.2mL／只不致死，到8倍稀釋液0.2mL／只全部致死，濾液對(duì)小鼠的最小致死量（MLD）最低為小于 5MLD／mL，最高達(dá)到 40 MLD／mL；不同批次的濾液卵磷脂酶效價(jià)也存在較大差異，最低為1∶2，最高為1∶64；分別用29個(gè)批次A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液，以10%的加入量處理濃縮IBV，制備IBV HI抗原，其抗原的HA效價(jià)均≥7log2。同批濾液小鼠MLD低，其卵磷脂酶效價(jià)也低，而濾液小鼠MLD高，其卵磷脂酶效價(jià)也高。表中第6、8、11、13、14、16、21、22、23、29批濾液沒(méi)有測(cè)出小鼠MLD，這些批次的濾液卵磷脂酶效價(jià)也較低，僅在1∶2～1∶8之間；濾液小鼠最小致死量為5MLD／mL時(shí)，卵磷脂酶效價(jià)在1∶16～1∶32之間；濾液小鼠最小致死量為10MLD／mL時(shí)，卵磷脂酶效價(jià)達(dá)到1∶32；濾液小鼠最小致死量高于20 MLD／mL時(shí)，卵磷脂酶效價(jià)達(dá)到1∶64。證明A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液的小鼠MLD與卵磷脂酶效價(jià)之間存在著明顯的正相關(guān)關(guān)系。而不論濾液的小鼠MLD和卵磷脂酶效價(jià)高或是低（在1∶2～1∶64之間），不同批濾液處理后IBV的HA活性均較好，其抗原HA效價(jià)均≥7log2，證明濾液處理IBV的HA活性與小鼠MLD和卵磷脂酶效價(jià)沒(méi)有明顯的關(guān)系。

表1 29批A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液小鼠最小致死量、卵磷脂酶效價(jià)、處理IBV后其HA效價(jià)試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Test results of minimum lethal dose in mice，lecithinase activity，HA activity of the treated IBV in 29batches of the culture filtrate of Clostridium perfringens type A

2.2 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液最小加入量試驗(yàn)

從29批A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液中選出10批，分別以1.25%～20%的量加入到100倍濃縮的IBV M41株病毒液中制備IBV HI抗原。從表2可以看出，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液的加入量與IBV M41株抗原血凝價(jià)存在相關(guān)關(guān)系，濾液加入量為1.25%時(shí)，IBV抗原效價(jià)在3log2～6log2之間；濾液加入量為2.5%時(shí)，IBV抗原效價(jià)基本均為6log2；濾液加入量為5%～20%時(shí)，IBV抗原效價(jià)在7log2～8log2之間。以5%～20%的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液處理濃縮的IBV M41株病毒液，均可制備出符合要求的IBV HI抗原，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液的最小加入量為2.5%～5%。

表2 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液加入量與IB HI抗原HA效價(jià)的關(guān)系Table 2 The relationship between the adding amount of the filtrate of type AClostridium perfringens and HA titer IB HI antigen

2.3 商品化卵磷脂酶C處理IBV的HA活性試驗(yàn)

3次不同酶加入量試驗(yàn)結(jié)果顯示，卵磷脂酶C的加入量為0.125U／mL至4U／mL均可制備出效價(jià)符合要求的抗原。分別用卵磷脂酶C及A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液處理制備出的2種抗原測(cè)定血清IBV HI效價(jià)，結(jié)果，IBV陽(yáng)性血清均為陽(yáng)性，SPF雞血清及其它病原陽(yáng)性血清均為陰性，且用這2種抗原所測(cè)定出的IBV HI效價(jià)結(jié)果完全相同。

2.4 卵磷脂酶C處理IBV獲得血凝活性的試驗(yàn)結(jié)果

將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液分別與A型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗血清和產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單因子血清在37℃條件下中和50min后，進(jìn)行卵磷脂酶活性試驗(yàn)及處理后IBV的HA活性試驗(yàn)。表3結(jié)果顯示，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液加等量HA緩沖液組（即濾液對(duì)照組）的卵磷脂酶效價(jià)為1∶32，處理IBV后出現(xiàn)了血凝活性，其HA價(jià)達(dá)到8log2，而兩種血清中和組樣品的卵磷脂酶效價(jià)均為0，證明兩種血清可有效地中和A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液中的卵磷脂酶C，然而，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液與A型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗血清中和的樣品處理IBV后，未出現(xiàn)血凝活性，而A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液與產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單因子血清中和的樣品，雖然卵磷脂酶效價(jià)為0，但處理濃縮IBV后，也出現(xiàn)了血凝活性，HA價(jià)達(dá)到6log2，提示可能還存在產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素（卵磷脂酶C）之外引起IBV抗原具有血凝活性的物質(zhì)。

表3 濾液抗血清、α毒素單因子血清與濾液的中和試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of neutralization test of the antiserum of the filtrate and theαtoxin with the filtrate

3 討論

對(duì)29批A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液進(jìn)行了小鼠致死性試驗(yàn)、卵磷脂酶活性試驗(yàn)、處理后IBV的 HA活性試驗(yàn)及制備IBV HI抗原的濾液最小加入量等試驗(yàn)，結(jié)果顯示雖然不同批次的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液的MLD、卵磷脂酶效價(jià)存在較大差異，但制備的IBV HI抗原的HA效價(jià)均達(dá)到了≥7log2，而且濾液最小加入量基本相同。這提示濾液中的卵磷脂酶C的含量與濾液使?jié)饪sIBV獲得HA活性沒(méi)有明顯的相關(guān)關(guān)系，卵磷脂酶C可能不是使?jié)饪sIBV獲得HA活性的物質(zhì)，而是濾液中其它未知的成分?！瓣懮鷦?dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)（哺乳動(dòng)物、禽鳥(niǎo)與蜜蜂）第五版，2004”第799頁(yè)中介紹，“最初發(fā)現(xiàn)商品化的Ⅰ型卵磷脂酶C可促進(jìn)HA活性，似乎是一個(gè)污染的酶而不是卵磷脂酶在發(fā)揮作用”［10］。根據(jù)這一推測(cè)我們對(duì)卵磷脂酶C在使IBV獲得血凝活性中所起的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果證明盡管A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液中的卵磷脂酶C被中和掉了，但其使IBV出現(xiàn)血凝活性的物質(zhì)仍然存在。試驗(yàn)結(jié)果看起來(lái)與商品化卵磷脂酶C能使IBV呈現(xiàn)血凝活性的事實(shí)不符，然而，進(jìn)一步了解得知商品化卵磷脂酶C也是由產(chǎn)氣莢膜梭菌制備的，我們推測(cè)在卵磷脂酶C的制備過(guò)程中可能由于純化不徹底，保留了能使IBV出現(xiàn)血凝活性的成分，從而直接導(dǎo)致了卵磷脂酶C能使IBV獲得血凝活性的假象。因此，以卵磷脂酶C的含量即小鼠MLD與卵磷脂酶效價(jià)來(lái)建立制備IBV HI抗原所用濾液的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，看來(lái)是不可行的。

用29個(gè)批次的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液，以10%的加入量處理濃縮IBV，制備IBV HI抗原，其IBV HI抗原的HA效價(jià)均達(dá)到≥7log2，均符合要求，這證明所制備的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液的質(zhì)量是穩(wěn)定的，可以充分保證所制備出的IBV HI抗原的質(zhì)量。根據(jù)以上結(jié)果，我們建立了制備IBV HI抗原所用濾液的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，即濾液處理IBV后的HA活性試驗(yàn)為濾液質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：取A型產(chǎn)氣莢膜梭菌濾液0.05mL加入到0.45mL 100倍濃縮的IBV M41株病毒液中，充分混勻，放37℃恒溫振蕩器感作2h，取出置2℃～8℃條件下48h，測(cè)定其HA效價(jià)，其IB HI抗原的HA效價(jià)應(yīng)≥7log2。該方法簡(jiǎn)單可靠，可直接反應(yīng)濾液使IBV獲得血凝活性的能力。

致謝：本研究得到了中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所細(xì)菌室蔣玉文主任的精心指導(dǎo)及大力幫助，在此表示深深的感謝！參考文獻(xiàn)：

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