周 旋 肖向紅 張晶鈺 柴龍會 牛曙東 呂 晨

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

東北林蛙(Rana dybowskii)，屬脊索動物門，兩棲綱，無尾目，蛙科。東北林蛙的養(yǎng)殖是我國經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)之一，具有很高的經(jīng)濟價值。近年來，東北林蛙種群數(shù)量逐年下降。研究顯示，蛙病毒屬的虹彩病毒(Rana grylio virus，RGV)是最重要的影響因素之一［1］。該病毒廣泛的宿主范圍、全球分布性以及高致病力，使得它們成為兩棲類全球性的威脅。NF－κB是參與機體先天免疫的一類重要模式識別分子，也是連接先天免疫和獲得性免疫的橋梁。研究證實，NF－κB信號通路是促炎癥基因表達的樞紐之一，可誘導(dǎo)細胞因子、趨化因子、粘附因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、環(huán)加氧酶2(cox2)和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNos)的表達［2］。但目前對NF－κB信號通路的研究多集中在哺乳動物，兩棲動物的NF－κB相關(guān)研究尚未見報道。本實驗以東北林蛙為研究對象，利用熒光定量PCR技術(shù)，觀察東北林蛙在受到RGV脅迫后，其體內(nèi)NF－κB和I－κB分子的時空表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物及毒株:東北林蛙，40只，健康、雄性，2～3齡，體質(zhì)量(20±2)g，2012年5月購自黑龍江省帽兒山林場;蛙虹彩病毒RGV9506，由中國科學(xué)院武漢水生生物研究所張奇亞教授饋贈，本實驗室傳代培養(yǎng)并保存。

主要試劑:Trizol Reagent，由美國 Invitrogen公司購買;瓊脂糖，由Biowest公司購買;GelRed核酸凝膠染料，由美國Biotium公司購買;2×Taq Master Mix、DNA Marker 2000、50 bp DNA Ladder，由天根生化科技有限公司購買;Prime Script? RT reagent Kit、Real Master Mix(SYBR ? Green Ⅱ)，由 Takara公司購買;小量膠回收試劑盒，由上海華舜生物有限公司購買。

1.2 總RNA提取和檢測

東北林蛙經(jīng)腹腔注射RGV 1 mL［3］(PBS稀釋為106/mL)脅迫刺激。分別于 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、24.0、48.0、72.0 h 后取背部皮膚、肝臟、脾臟，－80℃保存，以0 h為空白對照組。用Trizol法提取總RNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，紫外分光光度計檢測其吸光度。

1.3 RT-PCR擴增和電泳檢測

使用Primer premier 5.0軟件，根據(jù)實驗室高通量測序結(jié)果設(shè)計 β－actin、NF－κB1、NF－κB2和 I－κBα mRNA的上下游引物，引物由哈爾濱博仕生物公司合成。引物序列見表1。

表1 β－actin、NF －κB1、NF－κB2和 I－κBα 引物

取500 ng總RNA按照PrimeScript?RT reagent Kit說明書進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR反應(yīng)(以β－actin為陽性對照)。PCR反應(yīng)體系根據(jù)2×TaqMasterMix說明書配制，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min(94℃變性30 s，NF－κB1 56℃、NF － κB2 52.6 ℃、β －actin 54.5 ℃、I－ κBα 58.5℃退火30 s，72℃延伸1 min)，30個循環(huán)，72℃延伸5 min。產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.4 制作標準曲線

切膠回收目的基因PCR產(chǎn)物，通過紫外分光光度計測定回收產(chǎn)物吸光度及濃度，產(chǎn)物質(zhì)量濃度測定后，按下列公式計算各產(chǎn)物單位體積(單位:μL)的拷貝數(shù)(N)［4］:N=NA× C/MW。式中:NA為阿伏加德羅常數(shù);C為產(chǎn)物質(zhì)量濃度(單位:g/μL);MW為產(chǎn)物平均摩爾質(zhì)量(單位:g/mol，MW=片段長度bp×660/bp)。

用已測質(zhì)量濃度的切膠回收產(chǎn)物為母液制備質(zhì)量濃度梯度樣品，在25 μL反應(yīng)體系中分別加入1 μL各稀釋質(zhì)量濃度的樣品制作標準曲線。熒光定量PCR反應(yīng)體系按照Real Master Mix(SYBR?GreenⅡ)說明書配制，熒光定量PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s(95℃變性5 s，NF－κB1 56℃、NF－κB2 52.6 ℃、I－ κBα 58.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72℃讀板)，40個循環(huán)，95℃延伸15 s。在72～95℃區(qū)間，以0.5℃為遞增梯度進行溶解曲線分析。采用默認設(shè)置，自動生成C(t)值，每個樣品重復(fù)3次。

1.5 實時熒光定量PCR

熒光定量PCR反應(yīng)體系按照Real Master Mix(SYBR?GreenⅡ)說明書配制，熒光定量PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s(95℃變性5 s，NF－κB1 56℃、NF － κB2 52.6 ℃、I－ κBα 58.5 ℃退火 30 s，72℃延伸30 s，72℃讀板)，40個循環(huán)，95℃延伸15 s。在72～95℃區(qū)間，以0.5℃為遞增梯度進行溶解曲線分析。每個基因的cDNA樣本重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Opticon Monitor 3軟件分析定量結(jié)果，取C(t)值的均數(shù)根據(jù)標準曲線計算各樣品拷貝數(shù)。同一部位不同樣本之間表達量差異顯著性檢驗采用SPSS(18.0)的獨立樣本的T－test法。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取結(jié)果

利用紫外分光光度計檢測提取的各樣品組織總RNA的OD值，各樣本OD260/OD280全部在1.9～2.1之間，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA的18S、28S RNA條帶清晰(見圖1)，說明樣本無RNA降解、蛋白質(zhì)污染，總RNA質(zhì)量符合后續(xù)實驗要求。

圖1 東北林蛙組織總RNA電泳圖

2.2 RT-PCR擴增結(jié)果

取500 ng總RNA經(jīng)RT－PCR，得到目的條帶清晰(見圖2)，無特異擴增及引物二聚體，測序結(jié)果與引物設(shè)計時片段大小相吻合，且無雜帶，表明反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和特異性引物均滿足后續(xù)Real－timePCR實驗要求。測序結(jié)果與實驗室高通量測序結(jié)果一致。

2.3 標準曲線

選用初始模板拷貝數(shù)適宜的目的基因標準品為母液制備質(zhì)量濃度梯度樣品(NF－κB2為9.7×(10－1～103)拷貝數(shù)/μL;NF －κB1為1.55×(101～105)拷貝數(shù)/μL;I－κBα為1×(101～105)拷貝數(shù)/μL)。對每個質(zhì)量濃度的樣品，設(shè)定3個重復(fù)。圖3展示的是各標準品擴增產(chǎn)物起始模板質(zhì)量濃度的對數(shù)值與對應(yīng)C(t)值的關(guān)系圖，NF－κB2、NF－κB1、I－κBα的標準方程的回歸系數(shù)均在0.97以上，表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

圖2 目的基因RT－PCR產(chǎn)物電泳圖

圖3 目的基因標準曲線

2.4 NF － κB1、NF －κB2和I－κBα 定量結(jié)果

采用實時熒光定量PCR方法檢測RGV脅迫下，NF －κB1、NF－κB2和 I－κBα 在東北林蛙肝臟、脾臟、皮膚中10個時間點的時空表達情況。目的基因溶解曲線為一個明顯的峰(見圖4)，表明在擴增中引物特異性較好，產(chǎn)物單一。C(t)值經(jīng)標準方程計算出東北林蛙肝臟、脾臟、皮膚不同脅迫時間下的樣品初始拷貝數(shù)(見圖5)，在RGV刺激初期，與對照組相比形成NF－κB1和NF－κB2表達量立即大幅下調(diào)。從刺激后0.5 h，2個亞基在3個組織中都有上調(diào)趨勢，分別在刺激后2 h(肝臟)和4 h(皮膚)快速上調(diào)至峰值，NF－κB1和NF－κB2在肝臟中為760 bp和1082 bp、在皮膚中為551 bp和1 921 bp;在脾臟中2亞基上調(diào)趨勢緩慢，分別在16 h(NF－κB2)和24 h(NF －κB1)達到峰值，NF－κB1和NF－κB2分別為758 bp和659 bp。2亞基表達至峰值后開始下調(diào)，并在8 h(在肝臟中)和12 h(在皮膚中)下調(diào)至初始水平，在脾臟中2亞基72 h才達到初始水平。I－κBα在受刺激初期表達量也立即下調(diào)而后上調(diào)，并且其上調(diào)時間與NF－κB的上調(diào)時間點基本相同。統(tǒng)計學(xué)分析表明，定量結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖4 目的基因溶解曲線圖

3 討論

隨著全球環(huán)境的變化，生物多樣性不斷受到破壞，作為衡量生態(tài)環(huán)境優(yōu)劣的指示動物——兩棲動物數(shù)量正逐年減少。引起兩棲動物種群衰退的原因主要包括新引入的捕食者［5］、紫外線輻射的增加［6］、生境的破壞和退化、化學(xué)污染以及由病原微生物引起的感染性疾病的流行［7］等，其中感染性疾病流行與某些兩棲類種群的區(qū)域性滅絕有重要的關(guān)聯(lián)［8］。已有研究表明，蛙病毒屬RGV也是兩棲動物重要的病原之一［1］。RGV主要感染兩棲類、爬行類和硬骨魚類［9］。Brunner等［10］研究顯示，實驗室和野生條件下蠑螈(salamandrae)可作為病毒攜帶者而不發(fā)病，并在接觸RGV后能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答。

蛙類皮膚光滑潮濕并且無角質(zhì)層保護，其皮膚能夠分泌具有抗微生物活性的物質(zhì)，作為抵御病原微生物入侵的第一道屏障;肝血竇的枯否氏細胞具有吞噬作用;脾臟作為最活躍的免疫器官是血源性抗原產(chǎn)生應(yīng)答的主要場所。謝簡等［11］通過RGV人工感染美國青蛙(Rana grylio Stejneger)幼蛙經(jīng)免疫組化法檢測顯示，病毒感染呈現(xiàn)的陽性反應(yīng)可深達肝脾臟的實質(zhì)層，推測肝脾組織可能是RGV感染的主要靶器官?；诖耍緦嶒炓詵|北林蛙皮膚、肝臟和脾臟為靶器官，檢測RGV脅迫后各器官中NF－κB的表達變化。

圖5 NF－кB及I－кBα mRNA表達變化趨勢

核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF－κB)能與多種細胞基因啟動子或增強子序列特定位點發(fā)生特異性結(jié)合而促進轉(zhuǎn)錄和表達，在炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。NF－κB位于Toll樣受體(TLR)下游信號通路的樞紐位置，當細胞受到病原體刺激后產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，使NF－κB與I－κB解離，從而進入細胞核，與相應(yīng)的靶序列結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄表達，啟動針對病原微生物的固有免疫和獲得性免疫。在果蠅中，NF－κB/Rel同源蛋白 Dorsal和Dif由Toll受體激活，分別在幼體和成體抗真菌和革蘭氏陽性菌的免疫應(yīng)答中起轉(zhuǎn)錄激活作用［12］。王冬冬［13］研究顯示，中國明對蝦在受白斑綜合癥病毒(WSSV)刺激后Relish(哺乳動物NF－κB1和NF－κB2的同源蛋白)基因表達呈現(xiàn)先下調(diào)，而后上調(diào)，再下調(diào)，最后恢復(fù)正常水平的變化趨勢，并且可調(diào)控下游多種效應(yīng)因子對WSSV進行免疫防御。

兩棲動物是低等水生動物過渡到真正陸生動物的中間類型，在脊椎動物進化史上有著重要地位。本實驗通過熒光定量PCR檢測東北林蛙NF－κB的表達變化，結(jié)果顯示，在不同組織中NF－κB1和NF－κB2兩個亞基的表達水平有差異，NF－κB2表達量約是NF－κB1的2倍，且皮膚和脾臟中的表達量明顯高于肝臟。在RGV刺激下，與對照組相比，NF－κB1和NF－κB2表達量立即大幅下調(diào);肝臟和皮膚中，在刺激后2 h(在肝臟中)和4 h(在皮膚中)上調(diào)至峰值;在脾臟中，2亞基上調(diào)趨勢緩慢，分別在16 h(NF－κB2)和24 h(NF－κB1)達到峰值;2亞基表達至峰值后開始下調(diào)，并在8 h(在肝臟中)和12 h(在皮膚中)下調(diào)至初始水平，在脾臟中2亞72 h才達到初始水平。即:其表達變化呈現(xiàn)先下調(diào)，而后上調(diào)，再下調(diào)，最后恢復(fù)正常水平的趨勢，與WSSV刺激下對明蝦Relish基因的表達趨勢相同［13］。說明在受刺激初期，主要由皮膚和肝臟起到對RGV的抵制作用，但是在刺激后期則主要有脾臟起免疫調(diào)控作用。I－κBα在受刺激初期表達量也立即下調(diào)而后上調(diào)，其上調(diào)時間點與NF－κB的上調(diào)時間點基本相同。結(jié)果表明，NF－κB被激活后，I－κBα也立即上調(diào)表達，且與NF－κB結(jié)合，使其失去活性。NF－κB/I－κB信號通路與RGV的關(guān)系可能極其復(fù)雜和緊密，RGV可利用NF－κB1和NF－κB2基因來增強其自身基因的表達，達到自身復(fù)制繁殖的目的。東北林蛙也需要依靠NF－κB1和NF－κB2基因調(diào)控下游多種免疫相關(guān)因子來防御RGV。

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