梁楠松 曾凡鎖 李 博 郭 梁 詹亞光

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

逆轉(zhuǎn)座子(retrotransposons)廣泛分布在植物中，其種類繁多，是植物核基因組中重要的組成部分，它的增殖和轉(zhuǎn)座主要以RNA為中間產(chǎn)物(DNA→RNA→DNA)，反轉(zhuǎn)錄成 DNA，在插入到基因組中［1］，逆轉(zhuǎn)座子在植物基因組中有很高的拷貝性，對其序列的克隆與分析，以及對研究植物基因組組成、進化、系統(tǒng)發(fā)育、生物多樣性以及表達調(diào)控都具有重要的意義。逆轉(zhuǎn)座子包括長末端重復(fù)(long terminal repeat，LTR)和非長末端重復(fù)(non－LTR)兩類，LTR 又可分為 Ty1－copia類和 Ty3－gypsy類［2］，其中 Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子是目前所知道的數(shù)目最多、研究最深入的LTR類逆轉(zhuǎn)座子［3－4］。在植物逆轉(zhuǎn)座子中，多數(shù)的逆轉(zhuǎn)座子都是沒有活性的，而它們的活性受環(huán)境和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)。生物逆境脅迫和誘導(dǎo)能夠激活特定的逆轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄［5－7］，例如用MeJA處理煙草葉片能夠誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)座子中Tnt1A的轉(zhuǎn)錄活性，2，4－二氯苯氧乙酸(2，4－D)或水楊酸處理會使Tnt1C誘導(dǎo)表達［8］，2，4－D 還能夠誘導(dǎo)蘋果愈傷組織中 Ty1－copia 類逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄活性［9］。Kimur Y 等［10］人研究發(fā)現(xiàn)傷害、紫外誘導(dǎo)、MeJA和水楊酸等誘導(dǎo)能使OARE－1逆轉(zhuǎn)座子劇烈表達，說明OARE－1對非生物和生物脅迫都具有響應(yīng)。在植物、動物和微生物中都能檢測到同一類的逆轉(zhuǎn)座子，并且這些逆轉(zhuǎn)座子具有較高的相似性，說明逆轉(zhuǎn)座子不僅可以在世代中進行縱向傳遞，而且還可以在物種間進行橫向傳遞，逆轉(zhuǎn)座子在縱向和橫向傳遞過程中產(chǎn)生了高度異質(zhì)性，而它的水平傳遞成為了不同物種間聯(lián)系的橋梁。

白樺(Betula platyphylla Suk.)又稱樺木，是樺木科(Betulaceae)樺木屬(Betula Linn.)的一種。白樺是落葉喬木，樹皮白色、其扎根深，耐貧瘠，耐嚴寒，喜酸性土壤，適應(yīng)性強生長快，材質(zhì)優(yōu)良，是重要的工業(yè)樹種。白樺樹皮中含有的豐富的次生代謝產(chǎn)物具有醫(yī)療保健美容等重要功能，具有重大的開發(fā)價值。前人對誘導(dǎo)條件下提高白樺次生代謝產(chǎn)物的研究有很多報道但是對誘導(dǎo)脅迫下白樺逆轉(zhuǎn)座子克隆以及Tyl－copia類逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄活性的研究還未見報道。本試驗從白樺愈傷組織中分離克隆了Tyl－copia類逆轉(zhuǎn)座子部分逆轉(zhuǎn)錄酶序列，研究了誘導(dǎo)處理對Tyl－copia類逆轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄活性的響應(yīng)以及特性，為今后進一步研究逆轉(zhuǎn)座子對白樺次生代謝產(chǎn)物積累的響應(yīng)等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

白樺(Betula platyphylla Suk.)材料取自東北林業(yè)大學(xué)白樺強化種子園，并通過誘導(dǎo)白樺莖段獲取愈傷組織。

材料處理:愈傷組織分別經(jīng)2 mmol·L－1SNP和1 mmol·L－1MeJA 處理 12 h。

1.1 RNA的提取以及逆轉(zhuǎn)錄酶的擴增

RNA提取采用緩沖液冰浴CTAB法［11］，利用核酸蛋白分析儀，對提取的總RNA含量和質(zhì)量進行檢測。

RT－PCR:反轉(zhuǎn)錄用Oligo(dT)作下游引物合成cDNA第一條鏈，按照TaKaRa RNA PCR Kit操作指南進行。

引物:利用CODEHOP方法設(shè)計簡并引物，以RTpl和RTp2為引物擴增Tyl組逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT基因片段。RTp1序列為 5’－CAGATGGACGTGAAGamngcnttyyt－3’，RTp2 序列為 5’－GATCATCATGtmrtcnryrta－3’，其中 m 代表 A 或 C，n代表 A或T或C或G，y代表C或T，r代表A或G。

反應(yīng)體系:20 μL反應(yīng)體系中10×PCR buffer 2 μL，2.5 mmol·L－1的 dNTP 2 μL，上下游引物各 20 pmol，rTaq 0.2 μL，cDNA/DNA 模板 2 μL，DEPC 水補足 20 μL。

擴增:為了優(yōu)化反應(yīng)條件分別采用了兩種方法。①梯度 PCR，溫度梯度為 40、44.1、47.2、50.4、53 ℃。PCR程序為:94℃ 3 min;94℃ 30 s，退火45 s，72℃45 s，30個循環(huán);72℃ 7 min;4℃ 10 min。②采用兩次降落PCR，將第一次擴增產(chǎn)物稀釋100倍后經(jīng)過同樣的程序再次擴增富集PCR產(chǎn)物。程序為:94℃3 min;94℃ 30 s，53℃－0.8℃×n(n 為循環(huán)次數(shù))45 s，72 ℃ 45 s，10 個循環(huán);94 ℃ 30 s，45 ℃ 45 s，72 ℃45 s，20個循環(huán);72℃ 7 min;4℃ 10 min。

1.2 PCR產(chǎn)物的回收、克隆及純化

PCR產(chǎn)物采用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)的UNIQ－10柱式DNA膠回收試劑盒回收，連接寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的pMD18－T Vector，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)12～16 h，藍白斑篩選挑取白色克隆浸到含100 mg·mL－1AmplB液體培養(yǎng)基中，37℃搖6～10 h后PCR檢測。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄酶序列測定及序列分析

采用雙脫氧核苷酸鏈終止法，委托上海生工生物技術(shù)有限公司進行序列測定。獲得的序列用blastx、blastn在 GenBank中進行檢索分析，利用DNAMAN進行多序列比對，并利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果、重組質(zhì)粒的鑒定及測序

試驗初始參照Kumar等人［12］的研究結(jié)果，設(shè)計引物進行PCR擴增發(fā)現(xiàn)擴增結(jié)果不理想，后來利用CODEHOP(Consensus Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers)來設(shè)計簡并引物擴增的結(jié)果較好，并且通過梯度PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果來看(如圖1)，不同退火溫度對逆轉(zhuǎn)錄酶序列的擴增影響不大。但是在RT－PCR時，由于cDNA濃度太低，無法擴增出合適的條帶，故采取降落PCR，提高序列配對的準確性，同時采用二次擴增，將一次擴增產(chǎn)物稀釋100倍后作為模板進行二次擴增，來富集目的片段這樣的擴增效果可以較好可滿足后續(xù)實驗。

圖1 不同退火溫度對逆轉(zhuǎn)錄酶擴增的影響

2.2 未處理下Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄活性

在該實驗中，我們以未處理的白樺愈傷組織的RNA為模版，通過RT－PCR擴增獲得了一條大小為290 bp的序列，通過blastn和blastx證實其為Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子的逆轉(zhuǎn)錄酶基因的片段，blastx與Alstroemeria inodora的同源性為74%，命名為Bprt1。該序列包含下游YVDDML保守基序，但是上游的保守基序為TAFFHG，而非TAFLHG，有一個氨基酸的突變，即亮氨酸(L)突變?yōu)楸奖彼?F)，均為疏水氨基酸，屬于保守替換。從核酸的角度則是從CTT突變?yōu)門TT。另外，Bprt1存在一個終止密碼子。

應(yīng)用DNAMAN軟件對Bprt1的氨基酸序列比對(如圖2)，參與比對的序列有擬南芥逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 AAF02855、黑楊 CAC95126、果蠅 P04146、柑橘CAJ09951、番 茄 AAK29467、煙 草 P10978、煙 草BAA11674和玉米AAA57005等8種生物中逆轉(zhuǎn)座子的逆轉(zhuǎn)錄酶片段，其一致性為63.89%，Bprt1跟它們的同源性分別為 47.37%、41.49%、37.23%、52.63%、57.89%、61.05%、58.95%、38.95%。應(yīng)用軟件DNAMAN對Bprt1和8種生物的逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(如圖3)發(fā)現(xiàn)雖然白樺與黑楊的親緣關(guān)系最近，但是其對應(yīng)的RT基因的親緣性并非最近。

圖2 Bprt1與另外8種生物中Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列比對

圖3 白樺Bprt1與其他生物Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸系統(tǒng)進化樹

2.3 SNP和MeJA處理后Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄活性

在該實驗中，隨機挑取以2 mmol·L－1SNP進行處理12 h的白樺愈傷組織cDNA獲得的11個白色單克隆進行測序，獲得11條核酸序列，除一條為205 bp外，其他10條均在270 bp左右，經(jīng)blastn和blastx比對后確定為Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因，命名為Bprt2～Bprt12，核酸序列比對后一致性為 78.79%，如圖 4，異質(zhì)性為 1.1%～43.1%。隨機挑取以1 mmol·L－1MeJA處理12 h的愈傷組織cDNA為模版獲得的10個白色單克隆，得到的10條核酸序列中有兩條是完全一樣的，認為得到9條核酸序列，其大小均在270 bp左右，符合預(yù)期，經(jīng)blastn和blasrx比對后確定為Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因，命名為Bprt13～Bprt21，核酸序列比對后一致性為83.41%，如圖5，其異質(zhì)性為 1.1%～50%。如圖6，比對獲得的21條核酸序列，其一致性為 71.93%，異質(zhì)性為 1.1% ～50.9%，翻譯成氨基酸的異質(zhì)性為0～57.1%，說明逆轉(zhuǎn)座子具有高度的異質(zhì)性。

如圖7，應(yīng)用DNAMAN對獲得的21條轉(zhuǎn)基因白樺中Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶片段構(gòu)建進化樹，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過SNP誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄酶序列Bprt3、Bprt4、Bprt10、Bprt6、Bprt8 聚在一起，Bprt9和Bprt11聚在一起，Bprt7和 Bprt12聚在一起;而經(jīng)MeJA誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄酶序列Bprt13、Bprt17和Bprt18聚在一起、Bprt15和Bprt20聚在一起。說明逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子能夠響應(yīng)不同的信號而被激活，并且不同的誘導(dǎo)處理基本會使逆轉(zhuǎn)座子各自聚類。

2.4 白樺和蘋果Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的比對分析

轉(zhuǎn)座子的水平傳遞成為了不同物種間聯(lián)系的橋梁，在植物、動物和微生物中都能檢測到同一類的逆轉(zhuǎn)座子，并且具有較高的相似性。高等植物同類型的逆轉(zhuǎn)座子在縱向和橫向傳遞過程中產(chǎn)生高度異質(zhì)性［13］，這種異質(zhì)性有時種內(nèi)差異大于種屬間［14］。本實驗以白樺及蘋果為例分析了逆轉(zhuǎn)座子縱向傳遞的異質(zhì)性和一致性。

圖4 SNP誘導(dǎo)下白樺中Bprt2～Bprt12核酸序列比對

圖5 MeJA誘導(dǎo)下白樺中Bprt13～Bprt21核酸序列比對

圖6 白樺中Bprt1～Bprt21核酸序列比對

圖7 白樺Bprt1～Bprt21逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸系統(tǒng)進化樹

我們從GENEBANK中下載了蘋果(Malus×domestica Borka.)中的19條 Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列，序列號為DQ410748～DQ410766，其異質(zhì)性為21.3%～52.3%，將本實驗得到的21條序列與這19條的核酸序列比對，一致性為61.30%(如圖8)，種間異質(zhì)性為 28.2%～52.5%。進化樹分析，如圖9，白樺和蘋果中Ty1－copia類逆轉(zhuǎn)座子基本各自聚類，但是 Bprt9、Bprt11和 DQ410750進化關(guān)系比較接近聚為一類，Bprt15、Bprt19、DQ410751 和DQ410753的進化關(guān)系也比較接近。說明了逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子種內(nèi)變異較大，而且種間變異也較大，但是種內(nèi)變異可能大于種間。證明了逆轉(zhuǎn)座子不僅存在垂直傳遞，也存在水平傳遞。

圖8 白樺Bprt1－Bprt21和蘋果DQ410748～DQ410766的核酸序列比對

圖9 白樺Bprt1～Bprt21和蘋果DQ410748～DQ410766逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸系統(tǒng)進化樹

3 結(jié)論與討論

簡并度是簡并引物的種類數(shù)，是該簡并引物內(nèi)所有簡并堿基的簡并個數(shù)之積。本研究中采用CODEHOP設(shè)計簡并引物，所用的上游引物的簡并度為128、下游引物的簡并度也為128，簡并度較大，退火溫度為45℃，比較低，退火溫度的不適宜即過高會使PCR效率過低，過低則會使非特異擴增過多均會對后面克隆測序的結(jié)果產(chǎn)生影響。而且RT－PCR第一步獲得的cDNA的濃度也較低，因此在實驗中結(jié)合梯度PCR和降落PCR提高準確性，采用二次PCR使PCR產(chǎn)物富集提高濃度，達到的效果比較好。并且前后兩次采用同樣的引物序列對實驗結(jié)果沒有影響。

詹亞光等［15］于2001年開始通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法首次將bgt基因成功轉(zhuǎn)入白樺中，并獲得抗性植株，而基因沉默首先也是在轉(zhuǎn)基因植物中發(fā)現(xiàn)的，而轉(zhuǎn)基因植物是否成功不僅僅是在轉(zhuǎn)基因植株中檢測到外源基因，更重要的是外源基因能夠在植株中穩(wěn)定表達。而轉(zhuǎn)基因植株中常常會出現(xiàn)外源基因沉默的現(xiàn)象。而甲基化導(dǎo)致外源基因沉默也是一個抑制逆轉(zhuǎn)座子活性的重要調(diào)節(jié)機制，而轉(zhuǎn)座活性經(jīng)常與甲基化不足聯(lián)系在一起［16］，例如對去甲基化突變的研究表明轉(zhuǎn)座子和/或逆轉(zhuǎn)座子能夠在轉(zhuǎn)錄甚至在轉(zhuǎn)座水平上被激活，因而有力的證明胞嘧啶甲基化和轉(zhuǎn)座子的表達調(diào)控有密切的聯(lián)系［17］，并且逆轉(zhuǎn)座子的重復(fù)或插入也可誘導(dǎo)外源基因的基因沉默。隨著植物基因工程研究的深入，人們開始關(guān)注外源基因在轉(zhuǎn)化體及其子代中的整合穩(wěn)定性和表達有效性，從外源基因的整合特性、甲基化、外界因素等表觀遺傳的角度研究其表達狀況。本文選取白樺為實驗材料進行研究，也是為后續(xù)對轉(zhuǎn)基因白樺中逆轉(zhuǎn)座子DNA序列中胞嘧啶甲基化的頻率、重復(fù)序列的插入或者缺失以及逆轉(zhuǎn)座子的活性與外源基因的表達關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)為轉(zhuǎn)基因植株外源基因表達穩(wěn)定性提供參考依據(jù)。

在通常情況下，逆轉(zhuǎn)座子在植物中是沒有轉(zhuǎn)錄活性的，而只有受到生物或非生物脅迫后才可以被轉(zhuǎn)錄激活。SNP處理白樺懸浮細胞可以有效提高異黃酮等次生代謝產(chǎn)物的積累，而茉莉酸甲酯處理可以提高三萜類物質(zhì)、齊墩果酸和白樺脂醇等次生代謝產(chǎn)物的含量［18］，而異黃酮、三萜類物質(zhì)、齊墩果酸和白樺脂醇都具有很高的藥用價值。本文采用SNP和MeJA誘導(dǎo)處理，分別克隆回收到了11條和9條有轉(zhuǎn)錄活性的逆轉(zhuǎn)座子，通過分析發(fā)現(xiàn)應(yīng)用不同的脅迫誘導(dǎo)處理會聚集不同逆轉(zhuǎn)座子，初步證明不同的Tyl－copia類逆轉(zhuǎn)座子能夠分別響應(yīng)不同的信號而被轉(zhuǎn)錄激活。有研究表明，逆轉(zhuǎn)座子有捕捉植株內(nèi)源基因的誘導(dǎo)型啟動子的能力［19］，從而提高某些基因的表達。然而，白樺次生代謝產(chǎn)物的積累與逆轉(zhuǎn)座子之間的作用機理，還有待進我們一步的研究。

同一植物內(nèi)逆轉(zhuǎn)座子保守性較強如Bprt6和Bprt10的一致性高達98%。但同一植物內(nèi)的同一類型逆轉(zhuǎn)座子序列變異也較大，如Bprt1和Bprt15的一致性為50%;而不同物種間逆轉(zhuǎn)座子卻也可能有很高的相似性，這在其他物種上也得到了驗證［20－21］。Asins等［22］人研究發(fā)現(xiàn)柑橘基因組已經(jīng)積累了豐富的逆轉(zhuǎn)座子并且這些逆轉(zhuǎn)座子很可能是由病毒或病原菌為媒介在物種間傳遞而來。而本實驗中Bprt1與DQ410750一致性達到70%，這種相似性可能是逆轉(zhuǎn)座子間“橫向傳遞”的結(jié)果，這為研究物種的起源、進化途徑提供了依據(jù)。

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