孫中貫，劉 詠*，姚建銘，李 俊，朱素梅

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東 棗莊 277160；3.中國(guó)科學(xué)院等離子體物理研究所，安徽 合肥 230031；4.安徽科聚環(huán)保新能源有限公司，安徽 合肥 230031)

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)，俗稱腦黃金，是一種對(duì)人體非常重要的多不飽和脂肪酸(PUFA)，屬于Omega-3不飽和脂肪酸家族中的重要成員，是動(dòng)物和人體不能自身合成，必須從外界攝入的一類必需脂肪酸[1]。DHA對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)有重要的功能，具有健腦、提高記憶力和視力的作用，尤其可以促進(jìn)胎兒腦細(xì)胞發(fā)育和嬰幼兒腦細(xì)胞生長(zhǎng)，防治老年性癡呆及動(dòng)脈粥樣硬化、腦血栓等心腦血管疾病，受到食品界和醫(yī)療界的廣泛關(guān)注[2]。目前，DHA作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，已被運(yùn)用到乳制品、食用油、藻油軟膠囊、DHA沖劑等食品和營(yíng)養(yǎng)品中。

利用隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)ATCC30556發(fā)酵生產(chǎn)DHA具有發(fā)酵周期短、培養(yǎng)方式簡(jiǎn)單、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了傳統(tǒng)的從魚油中獲取DHA受原料、氣候、產(chǎn)地、生產(chǎn)周期等諸多限制因素的影響[3-4]。但原始藻種DHA產(chǎn)量較低，滿足不了工業(yè)化生產(chǎn)的要求。為了進(jìn)一步提高隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)DHA的能力，近年來國(guó)內(nèi)外的專家學(xué)者做了大量的研究。Wang Jufang等[5]對(duì)隱甲藻ATCC30556發(fā)酵生產(chǎn)DHA的氮源進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)優(yōu)化后生物量及DHA的產(chǎn)量分別達(dá)到了2.98g/L、527.97mg/L。Jiang Yue等[6]研究溫度對(duì)隱甲藻ATCC30556發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)將藻種先在25℃培養(yǎng)48h，然后在15℃繼續(xù)培養(yǎng)24h，DHA的產(chǎn)率最高為1.47mg/(L·h)。任路靜等[7]采用流加策略實(shí)現(xiàn)了隱甲藻ATCC30556生產(chǎn)DHA的高密度發(fā)酵。采用5d連續(xù)發(fā)酵多次流加策略，發(fā)酵結(jié)束后DHA含量?jī)H為0.0641g/g干物質(zhì)。榮輝等[8]利用紫外線對(duì)隱甲藻ATCC30556進(jìn)行誘變處理，得到的目的藻株DHA含量與出發(fā)藻株相比僅提高了28.39%。但目前，利用隱甲藻ATCC30556發(fā)酵生產(chǎn)DHA的研究仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，且使用的藻種DHA含量普遍較低。本實(shí)驗(yàn)擬通過對(duì)超誘變劑亞硝基胍誘變及誘變后的發(fā)酵條件控制，旨在獲得DHA含量高的優(yōu)良藻株，并確定誘變后隱甲藻的最佳發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 菌種

隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)ATCC30556，由武漢嘉吉烯王生物工程有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L、酵母膏3g/L、海鹽16g/L；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30g/L、酵母膏6g/L、海鹽16g/L、MgSO4·7H2O 5.0g/L、KH2PO40.1g/L、KNO35g/L、VB16mg/L、VB121μg/L，采用蒸餾水定容，調(diào)整pH值為7.0。

1.3 儀器與設(shè)備

722s可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DZF-6030B真空干燥箱 東莞市豪邦工業(yè)設(shè)備有限公司；GC-14C氣相色譜儀(配有氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)和N2000色譜工作站) 日本島津公司。

1.4 菌種培養(yǎng)方法

液體種子培養(yǎng)：25℃、100r/min振蕩培養(yǎng)72h；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：500mL三角瓶，裝液量10%，接種量10%，在25℃、120r/min條件下振蕩培養(yǎng)240h。

1.5 誘變方法

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的藻液分裝入10mL離心管中，每管1mL。加入亞硝基胍溶液[9]，使其最終質(zhì)量濃度依次為250、200、150、100、50、0μg/mL，室溫下處理30min后離心收集藻細(xì)胞，然后用磷酸緩沖液反復(fù)清洗3次，以除去誘變劑[10-12]。加入5mL無菌人工海水進(jìn)行稀釋后，取1mL接種于100mL三角瓶中，三角瓶裝液量為10mL，置于往復(fù)式搖床100r/min，25℃培養(yǎng)，培養(yǎng)5d后經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定各組的致死率。

1.6 篩選方法

大量研究[13]表明，致死率為80%左右的誘變處理有利于正突變的產(chǎn)生。選擇此致死率條件下誘變處理后培養(yǎng)的藻液進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)72h后取樣測(cè)定培養(yǎng)液OD520nm值。根據(jù)測(cè)定結(jié)果選擇OD520nm值較大的培養(yǎng)液作為種子液，進(jìn)行下一輪的分瓶培養(yǎng)，如此反復(fù)直至測(cè)定的培養(yǎng)液的OD520nm值無顯著差異為止。以此培養(yǎng)液為種子液進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以藻株的發(fā)酵生物量、總油脂產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量為篩選指標(biāo)，篩選出較出發(fā)藻株更優(yōu)良的突變株。

1.7 分析方法

1.7.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)取1mL藻液，加入5%冰醋酸，殺死藻細(xì)胞，于顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.7.2 致死率測(cè)定

參照Cafiavate等[14]的方法，將經(jīng)過誘變處理培養(yǎng)5d后的藻細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定細(xì)胞密度。根據(jù)回歸方程Y=aXb(其中Y為培養(yǎng)5d后的藻細(xì)胞密度，X為藻細(xì)胞的初始密度，此方程由設(shè)置不同初始密度的藻液培養(yǎng)5d后測(cè)定藻細(xì)胞密度，根據(jù)兩者數(shù)據(jù)擬合所得)推算上述誘變處理后的活細(xì)胞密度。每個(gè)誘變處理濃度隨機(jī)測(cè)3個(gè)樣，取平均值，計(jì)算致死率并繪制致死曲線。

式中：X1為未誘變處理的對(duì)照藻細(xì)胞密度/(個(gè)/L)；X2為誘變處理后的藻細(xì)胞密度/(個(gè)/L)。

1.7.3 生物量的測(cè)定取50mL樣液裝入預(yù)先稱質(zhì)量的離心管中，4000r/min 離心5min，沉淀用蒸餾水洗滌3次，50℃真空干燥，在干燥器內(nèi)冷卻后稱質(zhì)量，直至恒質(zhì)量。

1.7.4 油脂提取

采用Soxhlet法[15]提取菌體中的總油脂。

1.7.5 油脂處理

取50mg油脂，加入1mg十七烷酸，置于100mL的磨口燒瓶中，加入0.5mol/L氫氧化鉀的甲醇溶液2mL，于60℃水浴30min進(jìn)行皂化，冷卻后加入2mL三氟化硼-乙醚(體積比為1：1)溶液，60℃水浴10min，冷卻后加入5mL正己烷振蕩，然后加入5mL飽和食鹽水，靜置分層后取上層正己烷相，抽取上層可直接進(jìn)樣。

1.7.6 脂肪酸檢測(cè)

氣相色譜法，色譜條件為：毛細(xì)管色譜柱DB-23 (30m×0.32mm)，載氣為氮?dú)?。?nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)物為十七烷酸。采用程序升溫，140℃保持3min，10℃/min升溫，升溫至250℃，保持15min。

1.8 高產(chǎn)藻株遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

對(duì)挑選出的藻種連續(xù)傳代5次，分別進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)發(fā)酵生物量、總油脂產(chǎn)量及DHA的含量。

1.9 培養(yǎng)條件對(duì)目的藻株發(fā)酵的影響

1.9.1 起始pH值對(duì)目的藻株發(fā)酵的影響

配制不同pH值(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)的發(fā)酵培養(yǎng)基，作為起始培養(yǎng)pH值。在25℃、120r/min條件下振蕩培養(yǎng)240h。比較起始pH值對(duì)發(fā)酵生物量、總油脂產(chǎn)量及DHA含量的影響。

1.9.2 培養(yǎng)溫度對(duì)目的藻株發(fā)酵的影響

將接種的液體發(fā)酵培養(yǎng)基置于22、24、26、28、30℃環(huán)境中培養(yǎng)，在pH6.5、120r/min條件下振蕩培養(yǎng)240h。比較溫度對(duì)發(fā)酵生物量、總油脂產(chǎn)量及DHA含量的影響。

1.9.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)目的藻株發(fā)酵的影響

在pH6.5、26℃條件下振蕩培養(yǎng)240h，調(diào)節(jié)搖床的轉(zhuǎn)速分別為100、120、150、180r/min。比較搖床轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵生物量、總油脂產(chǎn)量及DHA含量的影響。

1.9.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)目的藻株發(fā)酵的影響

在pH6.5、26℃、120r/min的條件下，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。從發(fā)酵72h開始，每隔48h測(cè)定一次發(fā)酵生物量、總油脂含量及DHA產(chǎn)量，直至264h發(fā)酵結(jié)束。比較不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵生物量、總油脂產(chǎn)量及DHA含量的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 致死率的測(cè)定結(jié)果

采用上述誘變方法對(duì)隱甲藻ATCC30556進(jìn)行誘變處理，根據(jù)回歸方程Y=aXb推算處理后存活的藻細(xì)胞密度計(jì)算亞硝基胍對(duì)藻細(xì)胞的致死率，結(jié)果如圖1所示。

圖 1 亞硝基胍致死曲線Fig.1 Lethal curve of NTG

由圖1可知，亞硝基胍的質(zhì)量濃度在0～50μg/mL時(shí)，藻細(xì)胞死亡率逐漸上升至40%，當(dāng)質(zhì)量濃度超過50μg/mL時(shí)，曲線斜率增加明顯，誘變劑量與藻細(xì)胞死亡率幾乎呈線性關(guān)系。說明該藻株對(duì)質(zhì)量濃度超過50μg/mL的亞硝基胍溶液較敏感，當(dāng)誘變劑量由150μg/mL增至250μg/mL時(shí)，曲線斜率反而有所下降，說明該藻株對(duì)較高質(zhì)量濃度的亞硝基胍溶液有一定的抵抗能力。致死率高于90%的誘變劑量會(huì)對(duì)藻細(xì)胞造成較大影響，導(dǎo)致藻株活力下降生長(zhǎng)速度變慢，且負(fù)突變出現(xiàn)幾率較大，而采用低誘變劑量時(shí)，藻細(xì)胞對(duì)誘變作用敏感性較低，突變株性狀不穩(wěn)定。因此，利用誘變劑進(jìn)行目標(biāo)性狀的誘變育種時(shí)，選擇合適的誘變劑量是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。大量研究表明，致死率為80%左右的誘變劑量有利于正突變的產(chǎn)生，且在此致死率下對(duì)藻株的比生長(zhǎng)速率影響不大。因此根據(jù)致死曲線，綜合考慮實(shí)驗(yàn)的諸多因素，選擇致死率為79.4%的誘變劑量150μg/mL。

2.2 突變?cè)逯甑墨@得

對(duì)出發(fā)藻株進(jìn)行上述誘變處理，共篩選出4株DHA含量高于出發(fā)藻株的突變株。用篩選出的4株突變?cè)逯闘S1011、LS1022、LS1042、LS1057及出發(fā)藻株在相同的發(fā)酵條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，對(duì)各藻株發(fā)酵生物量、總油脂產(chǎn)量和DHA產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定，復(fù)篩結(jié)果見表1。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，在初始藻細(xì)胞密度相同情況下(均為106個(gè)/mL)，隱甲藻突變株LS1057 DHA含量明顯高于其他3株藻株LS1011、LS1022和LS1042。因此隱甲藻突變?cè)逯闘S1057是目的藻株。

表 1 高產(chǎn)DHA的突變?cè)逯闠able 1 Production of docosahexaenoic acid in fermentation broth of mutant strains

2.3 高產(chǎn)藻株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

表 2 傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 2 Genetic stability of the mutant microalgae strains during subculture

作為生產(chǎn)菌株，其遺傳穩(wěn)定性對(duì)于生產(chǎn)具有非常重要的作用，為此將隱甲藻LS1057進(jìn)行連續(xù)傳代發(fā)酵培養(yǎng)，并測(cè)定DHA含量的變化，結(jié)果見表2。DHA的含量與傳代前藻株相比無顯著差異，結(jié)果表明隱甲藻LS1057具有良好的遺傳穩(wěn)定性，連續(xù)5次傳代DHA的含量均維持在0.0697g/g干物質(zhì)左右，未發(fā)生原位恢復(fù)突變等情況。

2.4 培養(yǎng)條件對(duì)目的藻株發(fā)酵的影響

2.4.1 起始pH值對(duì)目的藻株發(fā)酵的影響

表 3 初始pH值對(duì)隱甲藻LS1057生長(zhǎng)及DHA產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of initial pH on biomass and docosahexaenoic acid yield of C. cohnii LS1057

目的藻株在不同起始pH值培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況，如表3所示。結(jié)果表明，突變株對(duì)培養(yǎng)基的起始pH有較好的適應(yīng)性，既可以在弱酸性條件(pH5.5)下生長(zhǎng)也可在弱堿性條件(pH7.5)下生長(zhǎng)。但在偏酸性的初始條件(pH6.5)下，突變株生長(zhǎng)情況最好，DHA的含量也是最高的。而王菊芳等[16]通過研究環(huán)境條件對(duì)隱甲藻ATCC30556生長(zhǎng)及DHA產(chǎn)量的影響發(fā)現(xiàn)隱甲藻生長(zhǎng)及DHA積累的最佳初始pH值為7.0，這可能是原始藻種經(jīng)誘變后某些生長(zhǎng)代謝途徑發(fā)生變化的緣故。當(dāng)pH值等于或大于7時(shí)，突變株在生長(zhǎng)過程中可能會(huì)引起溶液的pH值持續(xù)升高，從而引起溶液的滲透壓發(fā)生變化，導(dǎo)致藻細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的滲透壓平衡遭到破壞，進(jìn)而對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生抑制，嚴(yán)重的導(dǎo)致細(xì)胞死亡。以上結(jié)果表明，突變株產(chǎn)DHA的最佳初始pH值為6.5，過酸或過堿都會(huì)影響DHA的產(chǎn)量。

2.4.2 培養(yǎng)溫度對(duì)目的藻株發(fā)酵的影響

溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖的重要因素之一，溫度的變化會(huì)對(duì)微生物的代謝過程產(chǎn)生影響，通過改變它們的生長(zhǎng)速率，以適應(yīng)溫度的變化。培養(yǎng)溫度對(duì)隱甲藻的生長(zhǎng)繁殖以及DHA的產(chǎn)量都有重要的影響。培養(yǎng)溫度高，隱甲藻代謝旺盛，生長(zhǎng)繁殖較快，但不利于不飽和脂肪酸的積累。低溫培養(yǎng)，隱甲藻生長(zhǎng)速率較慢，但低溫有利于不飽和脂肪酸的積累。對(duì)于不同的隱甲藻藻種，最佳的培養(yǎng)溫度不同。

表 4 培養(yǎng)溫度對(duì)隱甲藻LS1057生長(zhǎng)及DHA產(chǎn)量的影響Table 4 Effect of culture temperature on biomass and docosahexaenoic acid yield of C. cohnii LS1057

由表4可知，培養(yǎng)溫度越高越有利于突變株的生長(zhǎng)繁殖因而生物量也就越高，總油脂和DHA的產(chǎn)量也相應(yīng)升高；在溫度為22～26℃的范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)溫度的升高，生物量、總油脂產(chǎn)量及DHA的產(chǎn)量逐漸增加，同時(shí)DHA的產(chǎn)量也逐漸升高。而在培養(yǎng)溫度為26～30℃的范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)溫度的升高DHA的含量幾乎呈直線下降，表明溫度過高不利于藻體內(nèi)DHA的產(chǎn)生和積累。這與Jiang Yue等[6]研究的溫度對(duì)隱甲藻ATCC30556生長(zhǎng)和DHA產(chǎn)量的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，也進(jìn)一步驗(yàn)證了溫度對(duì)隱甲藻生長(zhǎng)及DHA積累的影響情況。在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，可采用梯度降溫的方式，先將溫度設(shè)為30℃，發(fā)酵一段時(shí)間后再將溫度設(shè)為26℃，這將有利于提高DHA的最終產(chǎn)量。

2.4.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)目的藻株發(fā)酵的影響

搖床轉(zhuǎn)速越高越有利于突變株的生長(zhǎng)和DHA的積累，同時(shí)也表明突變株生長(zhǎng)和積累DHA需要較高濃度的氧。但微生物對(duì)搖床轉(zhuǎn)速都有一定的耐受性，轉(zhuǎn)速過高可能會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)過程中菌體裂解，從而影響菌體的正常生長(zhǎng)和產(chǎn)物的積累。

圖 2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)隱甲藻LS1057生長(zhǎng)及DHA產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of shaking speed on biomass and docosahexaenoic acid yield of C. cohnii LS1057

由圖2可知，在搖床轉(zhuǎn)速為100～180r/min的范圍內(nèi)，培養(yǎng)突變株的最佳搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，與Jiang Yue等[6]的研究結(jié)果相吻合。

2.4.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)目的藻株發(fā)酵的影響

圖 3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)隱甲藻LS1057生長(zhǎng)及DHA產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of cultivation time on biomass and docosahexaenoic acid yield of C. cohnii LS1057

由圖3可知，隨著時(shí)間的推移DHA產(chǎn)量先升高然后又下降。發(fā)酵216h時(shí)，生物量和DHA的產(chǎn)量達(dá)到最大，為縮短發(fā)酵周期提高發(fā)酵生產(chǎn)率，DHA的最佳收獲時(shí)間定為216h。這與Ratledg[17]、de Swaaf[18]等以葡萄糖為碳源，研究分批補(bǔ)料培養(yǎng)隱甲藻ATCC30772生產(chǎn)DHA的發(fā)酵工藝，發(fā)現(xiàn)通過流加質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的乙酸來控制培養(yǎng)基的pH值，在210h時(shí)菌體生物量和DHA的積累達(dá)到最大值的研究結(jié)果相接近。

3 結(jié) 論

3.1 利用亞硝基胍作誘變劑，以隱甲藻ATCC30556為出發(fā)藻株，在150μg/mL的誘變劑量下處理30min，經(jīng)過篩選得到一株高產(chǎn)DHA的突變?cè)逯闘S1057，且傳代實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明突變株遺傳性狀穩(wěn)定。證明利用亞硝基胍誘變選育DHA高產(chǎn)的隱甲藻藻株是一種行之有效的方法。

3.2 采用高溫?fù)u瓶培養(yǎng)的方式對(duì)誘變后的藻株進(jìn)行初篩，與隨機(jī)挑選[8]的方式相比具有很強(qiáng)的針對(duì)性且增加了高產(chǎn)藻株篩選的概率。

3.3 在初始pH 6.5、溫度26℃、轉(zhuǎn)速150r/min、培養(yǎng)時(shí)間216h的發(fā)酵條件下，突變株的生物量達(dá)到14.06g/L，比出發(fā)藻株11.59g/L提高21.31%；總油脂產(chǎn)量達(dá)到3.14g/L，比出發(fā)藻株1.85g/L提高69.73%；DHA的產(chǎn)量達(dá)到了1.057g/L，比出發(fā)藻株0.477g/L提高121.59%；DHA的含量由出發(fā)藻株的0.0412g/g干物質(zhì)提高到0.0752g/g干物質(zhì)，提高了0.825倍，且發(fā)酵周期提前了24h，為利用該藻株進(jìn)行DHA的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

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