張志強(qiáng)，李永成，易美華

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228）

目前，我國(guó)羅非魚(yú)加工產(chǎn)品主要是凍魚(yú)片和凍全魚(yú)兩大類[1]，在生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生大量的下腳料，其重量約占原料魚(yú)的40%～50%[2]，其中含有14.8%的粗蛋白，10.75%的粗脂肪，5.74%的灰分[3]。這些下腳料一般被加工成魚(yú)粉，此過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一定量含3%～5%蛋白質(zhì)的廢水，海南氣溫較高，這些廢水在腐敗菌的作用下，排放后3～5h內(nèi)產(chǎn)生惡臭，嚴(yán)重影響周?chē)髿馀c水體環(huán)境。因含有一定量的蛋白質(zhì)，它們有一定的利用價(jià)值，如可用來(lái)生產(chǎn)含氨基酸液體肥。但在實(shí)現(xiàn)其資源化前，必需首先對(duì)其進(jìn)行除臭處理。據(jù)報(bào)道[4-5]，惡臭物質(zhì)主要包括蛋白質(zhì)和氨基酸經(jīng)過(guò)脫羧及脫氨作用形成的含氮化合物，如：氨氣（NH3）、胺類（腐胺、尸胺、組胺、三甲胺等）、酰胺、吲哚和含氧有機(jī)物，如中間產(chǎn)物醛類、酮類、醚類。另外還有脂肪分解成的揮發(fā)性脂肪酸，含硫氨基酸分解產(chǎn)生的硫化氫、硫醇和硫醚等。并且可能引起人身體上的不適，對(duì)人體呼吸、消化、心血管、內(nèi)分泌及神經(jīng)系統(tǒng)都會(huì)造成不同程度的毒害，有些芳香族化合物甚至使人體產(chǎn)生畸變、癌變[6]。而對(duì)于惡臭的控制分為兩類：a.主動(dòng)控制：惡臭物質(zhì)產(chǎn)生之前，采取措施控制惡臭物質(zhì)的形成；b.被動(dòng)控制：對(duì)已經(jīng)產(chǎn)生的惡臭氣體進(jìn)行收集和處理[7]。本研究采用微生物處理技術(shù)，通過(guò)接種特定微生物，將羅非魚(yú)加工廢水中的蛋白質(zhì)分解成小肽和氨基酸。避免腐敗菌利用其中的蛋白質(zhì)形成臭味物質(zhì)，主動(dòng)控制惡臭氣體的產(chǎn)生，從而達(dá)到生物抑臭脫臭的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米曲霉（Aspergillus oryzae）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、生物除臭劑 購(gòu)自北京意科樂(lè)生態(tài)科技有限公司，主要成分為含有各種除臭功能的微生物；羅非魚(yú)加工廢水 取自海南省海南泉溢食品有限公司，存于4℃下冰箱中備用，經(jīng)測(cè)定，其主要成分參數(shù)為：干物質(zhì)含量10.67%，pH6.48，蛋白質(zhì)含量6.2%，脂肪含量0.54%，氨基氮0.3%。

TCYQ型搖床 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；超凈工作臺(tái) 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；手提式高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；雷磁PHS-3C型酸度計(jì)、723N型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；低速離心機(jī) 常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)基的配制

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基 以羅非魚(yú)加工廢水為基礎(chǔ)，自然pH，121℃滅菌20min備用。

1.2.2 液體種子培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基和肉湯培養(yǎng)基，121℃滅菌20min備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 種子制備 將活化的米曲霉菌接種到PDA液體培養(yǎng)基中，活化的枯草芽孢桿菌接種到肉湯液體培養(yǎng)基中，兩者均于180r/min，30℃下振蕩培養(yǎng)48h備用。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵 將上述1.2項(xiàng)中的發(fā)酵培養(yǎng)基分裝于7個(gè)500mL三角瓶中，每瓶100mL；3瓶加3%葡萄糖，分別接種3mL上述1.3.1項(xiàng)中米曲霉和枯草芽孢桿菌種子液和3mL生物除臭劑；3瓶不加葡萄糖，分別接種3mL上述1.3.1項(xiàng)中米曲霉和枯草芽孢桿菌種子液和3mL生物除臭劑；1瓶作為空白對(duì)照。以上瓶口均覆蓋六層紗布，于30℃、200r/min條件下在恒溫?fù)u床中連續(xù)發(fā)酵36h。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。并于室溫下繼續(xù)放置，每隔2d測(cè)定一次揮發(fā)性鹽基氮含量、pH以及對(duì)臭味進(jìn)行感官評(píng)定。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 分光光度法[8]：根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5—2010中的分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，分解產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，在pH4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的3，5-二乙酰-2，6-二甲基-1，4-二氫化吡啶化合物，在波長(zhǎng)400nm下測(cè)定吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)品比較定量。

本研究中采用TCA沉淀法預(yù)處理提取廢水中的蛋白質(zhì)：取一定量的發(fā)酵液與10% TCA混合，100℃水浴10min，蛋白質(zhì)與TCA充分結(jié)合，3000r/min離心，棄去上清液，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌后3000r/min再離心，棄去上清液后，蒸餾水少量多次洗滌沉淀于消化管中進(jìn)行消化。

1.4.2 揮發(fā)性鹽基氮含量測(cè)定 乙酰丙酮-甲醛分光光度法[9]：蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)，是蛋白質(zhì)腐敗產(chǎn)生的重要臭味物質(zhì)，這類物質(zhì)可以與廢水中有機(jī)酸結(jié)合，形成一種稱為鹽基態(tài)氮（+NH4·R-）的物質(zhì)，在pH 5～6的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的3，5-二乙酰-2，6-二甲基-1，4-二氫化吡啶化合物，在波長(zhǎng)412nm處測(cè)定吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)品比較定量。

1.4.3 臭味的感官評(píng)定 臭味等級(jí)描述法[10]（flavor rating assessment，F(xiàn)RA）與綜合評(píng)分法，該方法適用于天然水、飲用水、生活污水和工業(yè)廢水中臭的檢測(cè)，見(jiàn)表1。表1中，0分表示無(wú)臭味；1分表示微弱的臭味，勉強(qiáng)感覺(jué)存在（嗅覺(jué)閥值）；2分表示弱的臭味，確認(rèn)存在（認(rèn)知閥值）；3分表示明顯的臭味，極易感覺(jué)存在；4分表示很強(qiáng)的臭味，明顯存在；5分表示很強(qiáng)烈的臭味，難以忍受。嗅覺(jué)閥值是指人們勉強(qiáng)能夠嗅出氣味的最小濃度；認(rèn)知閥值是指人們勉強(qiáng)能夠分辨出氣味性質(zhì)的最小濃度。

表1 臭味等級(jí)強(qiáng)度描述Table 1 Description of odor grade and strength

2 結(jié)果與討論

2.1 各處理廢水中蛋白質(zhì)含量的變化

廢水中的蛋白質(zhì)被腐敗性細(xì)菌分解產(chǎn)生胺類化合物而產(chǎn)生惡臭味，因此要最大限度地消除廢水中的蛋白質(zhì)。本研究選用枯草芽孢桿菌、米曲霉、生物除臭劑對(duì)廢水進(jìn)行處理。結(jié)果表明（圖1）廢水蛋白質(zhì)含量均有所下降，但存在差異，說(shuō)明各微生物產(chǎn)生蛋白酶能力不同，對(duì)廢水中蛋白的分解利用程度有所不同。其中以枯草芽孢桿菌處理的廢水中蛋白質(zhì)消除率最大，這與枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶有關(guān)[11]，而米曲霉的蛋白酶酶系主要以中性蛋白酶為主[12]。在前人實(shí)驗(yàn)中[13-14]，堿性蛋白酶對(duì)羅非魚(yú)魚(yú)肉的綜合分解效果最好。在廢水中加入適當(dāng)?shù)腃源（葡萄糖），有利于蛋白質(zhì)的消除。這是由于葡萄糖的添加為微生物的繁殖提供了豐富的C源，從而使微生物大量繁殖，有利于產(chǎn)生蛋白酶；當(dāng)添加葡萄糖時(shí)，利用枯草芽孢桿菌處理，蛋白質(zhì)從對(duì)照的4.5g/100mL降低到0.8g/100mL。

圖1 不同處理廢水蛋白質(zhì)殘留量Fig.1 Protein residue with different processing method

2.2 揮發(fā)性鹽基氮含量的變化

由于羅非魚(yú)加工廢水中含有大量的蛋白質(zhì)，在雜菌的作用下產(chǎn)生臭味物質(zhì)胺類，如腐胺、尸胺、色胺、組胺、三甲胺、甲胺、乙胺、丙胺、吲哚等物質(zhì)，他們絕大多數(shù)屬于揮發(fā)性鹽基氮，因此揮發(fā)性鹽基氮含量是判斷廢水臭味的一個(gè)重要指標(biāo)。圖2表明廢水經(jīng)生物處理后，在室溫放置過(guò)程中，廢水中揮發(fā)性鹽基氮的變化情況。

圖2 不同處理中揮發(fā)性鹽基氮含量隨放置天數(shù)的變化Fig.2 The change of TVB-N content with the time

廢水中主要是蛋白質(zhì)和少量脂肪，糖類物質(zhì)極少。廢水中未加糖時(shí)（圖2A），各處理?yè)]發(fā)性鹽基氮的變化與對(duì)照均沒(méi)明顯區(qū)別，說(shuō)明未加糖時(shí)，廢水中微生物生長(zhǎng)缺乏C源，生長(zhǎng)受到限制，沒(méi)有很好分解蛋白質(zhì)。在加糖的各種處理組（圖2B）中，揮發(fā)性鹽基氮均比對(duì)照及未加糖處理組（圖2A）要低，主要是由于廢水缺少C源，廢水補(bǔ)充糖類后，有利于處理菌的生長(zhǎng)，形成優(yōu)勢(shì)菌群，充分分解利用蛋白質(zhì)和脂肪，使之成為小分子物質(zhì)，抑制腐敗菌的生長(zhǎng)，控制臭味物質(zhì)的產(chǎn)生。三種加糖處理的廢水在放置3d，揮發(fā)性鹽基氮沒(méi)明顯區(qū)別（圖2B）。但放置3d后，米曲霉處理的揮發(fā)性鹽基氮出現(xiàn)上升（圖2B），是由于該處理蛋白質(zhì)降解不完全（圖1中A處理），隨時(shí)間延長(zhǎng)，腐敗菌利用剩下的蛋白產(chǎn)生揮發(fā)性鹽基氮；而除臭劑與枯草芽孢桿菌處理的揮發(fā)性鹽基氮沒(méi)上升趨勢(shì)，說(shuō)明該處理蛋白質(zhì)分解完全（圖1中C與E處理）或形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，抑制腐敗微生物生長(zhǎng)?？莶菅挎邨U菌處理的揮發(fā)性鹽基氮在5d后還出現(xiàn)了下降趨勢(shì)，主要原因是其揮發(fā)性鹽基氮的產(chǎn)生受到了限制，同時(shí)海南天氣室溫比較高，可能揮發(fā)了部分揮發(fā)性鹽基氮。綜合看來(lái)，當(dāng)添加葡萄糖，用枯草芽孢桿菌處理，揮發(fā)性鹽基氮從對(duì)照的0.91g/100mL下降到0.04g/100mL，下降率95%。

2.3 pH變化

蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的氨基酸在腐敗菌作用下會(huì)脫羧脫酸，或產(chǎn)生腐敗性胺，均引起廢水的pH發(fā)生相應(yīng)變化，對(duì)其pH的跟蹤測(cè)定也能為研究臭味變化提供另一個(gè)途徑。如圖3，在未加葡萄糖的處理中（圖3A），其pH整體趨勢(shì)為上升，與揮發(fā)性鹽基氮的變化（圖2A）趨勢(shì)是一致的，說(shuō)明揮發(fā)性鹽基氮可使pH上升。在后期5～7d，pH略有下降，可能是其中的鹽基氮被其他微生物分解所致。但廢水添加糖后，微生物生長(zhǎng)迅速，將蛋白質(zhì)分解為氨基酸，pH呈下降趨勢(shì)?？捉ǖ萚15]報(bào)道，枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)過(guò)程中，伴隨有酸性抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生和積累，抑制腐敗菌生長(zhǎng)?？莶菅挎邨U菌在分解蛋白成為氨基酸的同時(shí)，也可能產(chǎn)生了酸性物質(zhì)，導(dǎo)致pH維持在4～5范圍內(nèi)。而王淑敏等[16]報(bào)道，在C源存在條件下，產(chǎn)酸微生物的生長(zhǎng)與pH的降低存在動(dòng)態(tài)平衡，抑制其他腐敗菌的生長(zhǎng)。在后期7d，pH雖略有升高，但仍保持酸性狀態(tài)，可能是其他各種復(fù)雜微生物生長(zhǎng)的結(jié)果。

圖3 不同處理中pH隨放置天數(shù)的增加的變化Fig.3 The change of pH with the increase of days

2.4 廢水臭味的感官評(píng)定

根據(jù)臭味等級(jí)描述法和綜合評(píng)分法對(duì)放置的廢水進(jìn)行感官評(píng)定，結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)對(duì)廢水臭味的嗅覺(jué)感官評(píng)定，發(fā)現(xiàn)隨著微生物發(fā)酵處理后的廢水放置時(shí)間的增加，枯草芽孢桿菌有很好地抑制臭味物質(zhì)產(chǎn)生的能力，這跟其產(chǎn)生的各種酶有著密切的關(guān)系。臭味物的產(chǎn)生與揮發(fā)性鹽基氮、pH呈正相關(guān)。

表2 各種處理后廢水的臭味感官評(píng)定Table 2 Sensory evaluation of odor with different processing method

3 結(jié)論

在羅非魚(yú)加工廢水中添加米曲霉、枯草芽孢桿菌、生物除臭劑進(jìn)行搖瓶發(fā)酵均能對(duì)廢水中的蛋白質(zhì)進(jìn)行降解，同時(shí)形成優(yōu)勢(shì)菌群，根除腐敗的根源，抑制腐敗菌的生長(zhǎng)。從蛋白質(zhì)分解、揮發(fā)鹽基氮及臭味的消除三方面綜合考慮，枯草芽孢桿菌附加3%葡萄糖處理廢水效果最好，其蛋白質(zhì)分解從對(duì)照的4.5g/100mL降低到0.8g/100mL，揮發(fā)性鹽基氮從對(duì)照的0.91g/100mL下降到0.04g/100mL，下降率為95%，臭味等級(jí)水平降低，達(dá)到分解有機(jī)物，控制臭味物質(zhì)產(chǎn)生的效果。目前，面對(duì)海南省羅非魚(yú)加工廢水處理方式粗放滯后的現(xiàn)狀，微生物除臭處理技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的掩蔽、吸附等處理方法，具有處理效率高，處理后可進(jìn)一步綜合利用與資源化等優(yōu)點(diǎn)，具有廣泛的環(huán)境效益和經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)海南省羅非魚(yú)加工價(jià)值的延伸和產(chǎn)業(yè)技術(shù)升級(jí)有重要意義。

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