鄧浩，高波，王文芝，盧衛(wèi)紅＊，王振宇

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 極端環(huán)境營(yíng)養(yǎng)與防護(hù)研究所，哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱 150090；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 附屬第二醫(yī)院）

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)松科植物的體內(nèi)含有大量的多酚類化合物，具有一系列獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)和生物活性，統(tǒng)稱為松多酚。該類化合物具有抗氧化、清除體內(nèi)自由基、降血脂、吸收紫外線、抗癌抗腫瘤、消毒殺菌、除臭等多種生理活性；能與蛋白質(zhì)、生物堿、多糖結(jié)合，并可與多種金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，多酚中含有酚羥基等多種官能團(tuán)，可以通過(guò)氫鍵、疏水鍵或者共價(jià)鍵與高分子化合物接枝、共聚或共混，可以制備出一系列新型先進(jìn)材料，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、皮革、化妝品、保健品及高分子材料等領(lǐng)域。柚皮素是柚皮甙的甙元，屬于二氫黃酮類化合物。黃酮類化合物的母核結(jié)構(gòu)相似，多數(shù)成分脂溶性和水溶性不甚理想，生物利用度低。柚皮素具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化、止咳祛痰、降血脂、抗癌抗腫瘤、解痙和利膽、預(yù)防和治療肝病、抑制血小板凝結(jié)、抗粥樣動(dòng)脈硬化等作用，可被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。

植物多酚生物合成的起始底物為香豆酰－CoA和丙二酰－CoA，而香豆酰－CoA來(lái)源于苯丙烷類代謝途徑，丙二酰－CoA來(lái)源于乙酰－CoA。它們?cè)诓闋柾铣擅福–HS）作用下形成查爾酮，由查爾酮異構(gòu)酶催化查爾酮形成柚皮素，柚皮素作為主要代謝產(chǎn)物分三個(gè)途徑合成多酚類物質(zhì)。柚皮素作為多酚合成的必需中間產(chǎn)物，對(duì)多酚的合成具有重要的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于探究光照對(duì)松多酚和柚皮素含量影響實(shí)驗(yàn)樣本采集于哈爾濱工業(yè)大學(xué)二校區(qū)內(nèi)。從不同松樹的不同位置剪取松針，并標(biāo)記為底部陽(yáng)面、底部陰面、中部陽(yáng)面、中部陰面。

用于探究營(yíng)養(yǎng)、激素對(duì)松多酚和柚皮素含量影響實(shí)驗(yàn)樣本采集于實(shí)驗(yàn)室土培松樹苗。營(yíng)養(yǎng)條件：大量元素包括硝酸鉀3g、硝酸鈣5g、硫酸鎂3g、磷酸銨2g、硫酸鉀1g、磷酸二氫鉀1g。微量元素乙二胺四乙酸二鈉100mg、硫酸亞鐵75mg、硼酸30mg、硫酸錳20mg、硫酸鋅5mg、硫酸銅1mg、鉬酸銨2mg。分別配置成6、8、10、12L的營(yíng)養(yǎng)液。標(biāo)號(hào)為營(yíng)養(yǎng)1、營(yíng)養(yǎng)2、營(yíng)養(yǎng)3、營(yíng)養(yǎng)4。分別澆灌不同組的土培松針，每次100mL，每3天一次。激素條件：稱量適量的生長(zhǎng)激素（萘乙酸），配置成濃度為20、40、60、80mg／L的溶液。噴灑到生長(zhǎng)激素組的松針上，每次10mL，每3天一次。分別標(biāo)號(hào)為激素1、激素2、激素3、激素4。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

SPECORD200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（成都貝斯達(dá)儀器有限公司）；R－1002旋轉(zhuǎn)蒸餾儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；LDZ5－2離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；SHB循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

準(zhǔn)確最取標(biāo)樣沒(méi)食子酸溶液（100μg／mL）0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35mL 于10mL 比色管中，加蒸餾水至2mL，搖勻后加1.0mL福林試劑，4min后加入1.0mL 10%的碳酸鈉溶液，75℃水浴下保持15min后測(cè)定溶液在765nm處的吸光值。獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

Y ＝0.1704 X －0.042，R2＝0.9996。

1.3.2 柚皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

準(zhǔn)確稱取0.005g柚皮素標(biāo)準(zhǔn)品，用95%乙醇溶解定容至50mL。分別精密吸取該溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL 于7個(gè)10mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，然后在最大吸收波長(zhǎng)下以95%乙醇為參比測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)稀釋液在290nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程：

Y ＝0.0551 X ＋0.033，R2＝0.9994。

1.3.3 樣品前期處理

從松枝上采取松針，用剪刀將松針剪細(xì)后置于干燥皿中，并做好標(biāo)記，進(jìn)行冷凍干燥，直至樣品完全干燥后取出，在室溫下放置30min后用粉碎機(jī)將松針?lè)鬯槌煞勰?，用篩子將粉篩出，備用。

1.3.4 松多酚含量的測(cè)定

稱量各樣本粉末2g，取兩份，放入250mL三角瓶中，加入250mL 65%的乙醇，超聲輔助提取松多酚和柚皮素。參數(shù)設(shè)置：提取溫度75℃；提取時(shí)間45min。將提取液抽濾定容至250mL，取1mL抽濾液，于10mL比色管中，用65%乙醇定容至刻度，準(zhǔn)確吸取1mL的松針提取液于10mL比色管中，加蒸餾水至總體積為2mL。加入1.0mL福林試劑后搖勻，4min后加入1.0mL碳酸鈉溶液，25℃水浴下保持2h（75℃水浴15min）后測(cè)定溶液在765 nm處的吸光度值。將吸光度值代入沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出所測(cè)溶液中多酚的濃度，然后算出樣品中多酚類成分含量。

1.3.5 柚皮素含量的測(cè)定

將超聲輔助提取的松針?lè)勰┤芤撼闉V，得到上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將獲得的上清液旋蒸干，得到固體粉末。利用95%的乙醇溶液將固體粉末溶解，裝入10mL離心管中，然后進(jìn)行離心（3500r／min，15min）。離心后記錄所得柚皮素溶液的體積。將得到的柚皮素溶液用95%的乙醇溶液稀釋一定的倍數(shù)，以95%的乙醇溶液為參照，測(cè)定各樣本稀釋液在290nm處的吸光度。將測(cè)得的吸光度值代入柚皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到柚皮素稀釋溶液的濃度，最后計(jì)算出各樣本中柚皮素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)期光照對(duì)松多酚、柚皮素含量的影響

將松針從松樹的不同部位上采集下來(lái)，進(jìn)行前期處理后，測(cè)定各樣本中松多酚和柚皮素的含量。不同時(shí)期樣本中松多酚和柚皮素含量測(cè)定結(jié)果平均值列于表1中。

表1 松針中松多酚和柚皮素的含量

根據(jù)表1數(shù)據(jù)，對(duì)不同時(shí)期樹1和樹2中松多酚含量，作出假設(shè)檢驗(yàn)，經(jīng)t檢驗(yàn)，P＜0.05，差異顯著。隨著時(shí)間的推移，光照時(shí)間延長(zhǎng)，光照強(qiáng)度增加，松針中多酚的含量逐漸增加，松針中松多酚含量最高值達(dá)到43.06mg／g。說(shuō)明光照對(duì)松多酚的合成具有促進(jìn)作用。

對(duì)不同時(shí)期柚皮素含量作出假設(shè)檢驗(yàn)，經(jīng)t檢驗(yàn)，P＞0.05，差異不顯著。隨著時(shí)間的推移，松針中柚皮素含量變化不顯著。柚皮素是多酚合成的中間產(chǎn)物，由于光照促進(jìn)了多酚的合成，說(shuō)明光照能促進(jìn)柚皮素的合成。柚皮素含量沒(méi)有增加的可能原因是：光照同時(shí)能促進(jìn)柚皮素參與新陳代謝，使部分柚皮素消耗。

2.2 營(yíng)養(yǎng)和激素對(duì)松多酚、柚皮素含量的影響

購(gòu)買土培松針苗，在不同營(yíng)養(yǎng)和激素條件下培養(yǎng)，其他外界條件保持一致。培養(yǎng)1個(gè)月后，從松樹苗上采集松針，進(jìn)行前期處理后，測(cè)定松針中多酚和柚皮素的含量。實(shí)驗(yàn)測(cè)得結(jié)果平均值列于表2中。

表2 松針中松多酚和柚皮素含量

根據(jù)表2數(shù)據(jù)，在營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組中：對(duì)松針中多酚含量作出假設(shè)檢驗(yàn)，經(jīng)t檢驗(yàn)，P＜0.05，差異顯著。在一定營(yíng)養(yǎng)濃度范圍內(nèi)，隨著營(yíng)養(yǎng)液濃度的上升，松針中松多酚含量明顯增加，松多酚含量最高值為42.21mg／g，說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)對(duì)松多酚的合成具有促進(jìn)作用。對(duì)松針中柚皮素含量作出假設(shè)檢驗(yàn)，經(jīng)t檢驗(yàn)，P＞0.05，差異不顯著。

在生長(zhǎng)激素實(shí)驗(yàn)組中：各樣本中松多酚含量，經(jīng)t檢驗(yàn)，P＜0.05，差異顯著。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著噴灑的生長(zhǎng)激素（萘乙酸）濃度的增加，松針的生長(zhǎng)速度加快，松針中松多酚的含量增加，最高含量為44.35mg／g。說(shuō)明生長(zhǎng)激素對(duì)多酚的合成具有促進(jìn)作用。松針中柚皮素含量經(jīng)t檢驗(yàn)，P＞0.05，差異不顯著。

3 結(jié)論

本論文研究了不同外界因素對(duì)松針中松多酚、柚皮素含量的影響，通過(guò)利用比色法測(cè)定不同外界條件培養(yǎng)的松針中松多酚和柚皮素的含量。得到的主要結(jié)論如下：

3.1 隨著時(shí)間的推移，光照時(shí)間延長(zhǎng)，光照強(qiáng)度增加，松針中多酚的含量逐漸增加。說(shuō)明光照對(duì)松多酚的合成具有促進(jìn)作用。但松針中柚皮素含量變化不顯著。說(shuō)明光照能促進(jìn)柚皮素的合成，但同時(shí)光照也促進(jìn)柚皮素的新陳代謝，使部分柚皮素消耗。

3.2 用不同濃度的營(yíng)養(yǎng)液澆灌松針，發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)，隨著營(yíng)養(yǎng)液濃度的上升，松針中的松多酚含量明顯增加，說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)能促進(jìn)松多酚的合成。隨著營(yíng)養(yǎng)液濃度的上升，松針中柚皮素含量變化不明顯。

3.3 使用不同濃度的生長(zhǎng)激素（萘乙酸）噴灑松樹苗，發(fā)現(xiàn)松針的生長(zhǎng)速度加快。在一定生長(zhǎng)激素濃度范圍內(nèi)，隨著生長(zhǎng)激素濃度上升，松針中松多酚含量增加，說(shuō)明生長(zhǎng)激素能促進(jìn)松多酚的合成。在一定生長(zhǎng)激素濃度范圍內(nèi)，隨生長(zhǎng)激素濃度上升，松針中柚皮素含量增加，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，松針中的柚皮素含量反而降低，當(dāng)生長(zhǎng)激素濃度為80mg／L時(shí)，松針中柚皮素含量最高。

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