趙竹青,張海霞,孫冬梅,陳志寶,阮洪生,葛文中
(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,大慶 163319)
近年來,甾體肟衍生物因其抗炎、抗癌、抗真菌等獨特的生物活性[1-3]受到廣泛的關(guān)注。Sikharulidze M I 等[4]合成的一種二肟甾體對擲孢酵母、光華念珠菌、青霉菌、土曲霉、煙曲霉和尼日爾霉等多種真菌都有抑制作用,這種抑制作用甚至同兩性青霉素和抑真菌素作用相當(dāng)。Deive N 等[5]從天然產(chǎn)物出發(fā)合成了一系列側(cè)鏈不同、A 環(huán)飽和度不同的C-6 甾體酮肟衍生物,對小鼠白血病細(xì)胞(P-388)、人肺癌細(xì)胞(A-549)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29)和黑色素瘤細(xì)胞(MEL-28)的細(xì)胞毒性研究,結(jié)果表明具有膽甾醇側(cè)鏈C-3 酮肟比其他類型的甾體酮肟抗腫瘤活性更高。田光輝等[6]合成的環(huán)氧孕酮-3,20-二肟對傷寒沙門菌50 127 株、鼠傷寒沙門菌50 013 株、金黃色葡萄球菌25 925 株和肺炎球菌32 201 株都有較強的抑制作用和滅活作用,特別是對金黃色葡萄球菌25 925 株和肺炎球菌32 201 株更為明顯。
我們實驗室合成了16α,17α-環(huán)氧孕甾烯醇酮肟、孕甾烯醇酮肟等一系列的甾體酮肟化合物,研究結(jié)果表明其具有一定的生理活性[7]。目前,對甾體二肟結(jié)構(gòu)的全歸屬文獻(xiàn)報道不多,現(xiàn)以17α-OH 黃體酮為原料合成甾體二肟化合物,通過1H NMR 和13C NMR 檢測,對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)解析,為進(jìn)一步分析其活性起到參考作用。
17α-OH 黃體酮、鹽酸羥胺、95%乙醇、乙酸鈉,實驗所用各種試劑均為分析純。
LABOROTA-4000 旋蒸儀。所有NMR 實驗在Bruker AVANCE DPX-400 超導(dǎo)核磁共振儀上進(jìn)行,樣品以DMSO-d6為溶劑,TMS 為內(nèi)標(biāo)。
17α-OH-孕甾-4-烯-3,20-二肟的合成路線如圖1 所示。
圖1 化合物2 的合成路線Fig.1 The synthesis route of the compond 2
將0.75 g 17α-OH 黃體酮(化合物1) 溶于75 mL 的95%的乙醇中,置于100 mL 的圓底燒瓶中,攪拌加熱到70 ℃,加入1.20 g 乙酸鈉和0.52 g鹽酸羥胺,TLC 檢測反應(yīng)8 h。反應(yīng)完全后加入蒸餾水100 mL,充分?jǐn)嚢?,待白色物質(zhì)完全析出后,進(jìn)行抽慮,真空干燥得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚=1∶2.5做淋洗劑進(jìn)行柱層析分離得到0.37 g 產(chǎn)物17α-OH-孕甾-4-烯-3,20-二肟(化合物2),收率45.23%。
反應(yīng)是通過對反應(yīng)時間、溫度和反應(yīng)物之間摩爾比的控制進(jìn)行的。溫度太高,反應(yīng)產(chǎn)物的種類會增多,分離困難,因此溫度控制在50~70 ℃之間。反應(yīng)時間小于8 h 時,會生成單肟化合物,所以反應(yīng)時間應(yīng)該控制在8 h 以上,才能得到二肟化合物,原料:NH2OH·HCl=1∶3 時,3,17 位的酮基都能進(jìn)行肟化,得到主要產(chǎn)物是二肟的甾體化合物。
對化合物2 進(jìn)行1H NMR 和13C NMR 檢測,并對其2D NMR 圖譜相關(guān)數(shù)據(jù)(表1)詳細(xì)解析,對1H NMR 和13C NMR 數(shù)據(jù)全歸屬。
表1 化合物2 的2D NMR 圖譜相關(guān)數(shù)據(jù)Table 1 The 2D NMR data of the compond 2
續(xù)表1 化合物2 的2D NMR 圖譜相關(guān)數(shù)據(jù)Table 1 The 2D NMR data of the compond 2
在化合物2 的13C NMR 譜圖(圖2)中顯示有21個信號峰,結(jié)合DEPT 譜圖(圖7),推測有伯碳3 個,仲碳8 個,叔碳4 個,季碳6 個。
在1H NMR 譜圖(圖3)中,位于δ0.54、δ1.00 和δ1.73 三處的峰型都是單峰,并且質(zhì)子數(shù)是3,所以判斷這三處都是甲基峰。HSQC 譜圖(圖5)表明,δ15.1、δ17.5 和δ11.2 分別與δ0.54、δ1.00 和δ1.73 相偶合,與化合物1 的13C NMR 圖譜相對比,可以將δ15.1和δ17.5 歸屬為C-18 和C-19 的化學(xué)位移。則δ11.2為C-21 的化學(xué)位移。而δ0.54、δ1.00 和δ1.73 可分別歸屬為H-18、H-19 和H-21。在1H NMR 譜中,δ10.39 和δ10.47 處的峰,與化合物1 的1H NMR 圖譜比較,是肟羥基氫的化學(xué)位移。
圖2 化合物2 的13C NMR 圖譜Fig.2 The 13C NMR spectrum of compound 2
圖3 化合物2 的1H NMR 圖譜Fig.3 The 1H NMR spectrum of compound 2
HMBC 譜圖(圖4)中,H-18(δ0.54)、H-21(δ1.73)與δ84.4 處有交叉峰;DEPT 譜圖顯示δ84.4 峰為季碳,結(jié)合化合物1 的13C NMR 圖譜,δ84.4 峰歸屬為C-17。根據(jù)HMBC 譜圖,H-21(δ1.73)與δ157.9 處有交叉峰,則可將δ157.9 歸為C-20 的化學(xué)位移。H-19(δ1.00)與δ152.7 有相關(guān)偶合,而在DEPT 譜圖中,此處無峰,為季碳,因此可將δ152.7 歸為C-5 的化學(xué)位移。與化合物1 的13C 譜圖相比,δ117.8 處可歸屬為C-4,結(jié)合HSQC 圖,把δ5.7 峰歸屬為H-4。
在HMBC 譜圖中,H-18(δ0.54)應(yīng)與C-12、C-13、C-14 和C-17(δ84.4)有偶合關(guān)系,H-18(δ0.54)分別與δ46.5、δ49.2、δ30.9 和δ84.4(C-17)有交叉峰,而DEPT 譜圖中,δ30.9、δ46.5 和δ49.2 峰分別是仲碳、季碳、叔碳,因此可分別將其歸屬為C-12、C-13 和C-14。在HSQC 譜圖中與δ30.9(C-12)對應(yīng)的δ1.41 和δ1.76 歸為H2-12 的化學(xué)位移,而δ49.2(C-14),相對應(yīng)的δ1.76 歸屬為H-14。
圖4 化合物2 的HMBC 圖譜Fig.4 The HMBC spectrum of compound 2
HMBC 譜圖表明,H-19(δ1.00)應(yīng)與C-1、C-5、C-9 和C-10 有偶合關(guān)系。而H-19 與δ34.4、δ53.1 和δ37.4 處有交叉峰,在DEPT 譜圖中顯示,δ34.4、δ53.1和δ37.4 處分別為仲碳、叔碳和季碳,因此,可將其分別歸屬為C-1、C-9 和C-10 的化學(xué)位移。HSQC 譜圖將與δ34.4(C-1)相關(guān)聯(lián)的δ1.83 和δ1.24 歸屬為H2-1 的化學(xué)位移;將與δ53.1(C-9)相關(guān)聯(lián)的δ0.77歸屬為H-9。
圖5 化合物2 的HSQC 圖譜Fig.5 The HSQC spectrum of compound 2
根據(jù)1H-1H COSY 譜圖(圖6)可知H-4(δ5.7)有δ2.27 有交叉峰,這是H-4 與H-6 的遠(yuǎn)程偶合作用,所以將δ2.27 歸屬為H-6,結(jié)合HSQC 譜圖將δ31.7歸屬為C-6,而δ31.7 與δ2.19 處也有交叉峰,因此將δ2.27 和δ2.19 都?xì)w為H2-6。H-6 和H-7 直接偶合,根據(jù)1H-1H COSY 譜圖將δ1.76 和δ1.41 歸為H2-7,通過HSQC 譜圖將δ32.1 歸為C-7。
圖6 化合物2 的1H-1H COSY 圖譜Fig.6 The 1H-1H COSY spectrum of compound 2
HMBC 譜圖表明,H-4(δ5.7)與δ18.5、δ31.7(C-6)和C-10(δ37.4)有交叉峰,將δ18.5 峰歸屬為C-2。結(jié)合HSQC 譜圖將δ2.89 和δ1.95 歸屬為δH2-2。
在HMBC 譜圖中,H-14(δ1.76) 與δ22.9 和δ35.7 兩處碳峰有交叉相關(guān),DEPT 譜(圖7)中顯示δ22.9 與δ35.7 峰分別為伯碳和叔碳,因此δ22.9、δ35.7 兩處分別歸屬為C-15 和C-8。利用HSQC 譜圖將與δ22.9(C-15)偶合的δ1.59 和δ1.13 歸屬為H2-15,而與δ35.7(C-8)偶合的δ1.42 氫峰歸屬為H-8。由1H-1H COSY 得知,δ1.72、δ0.92(H2-7)與δ0.77(H-9)和δ1.42 有相關(guān)偶合,H-8 的化學(xué)位移為δ1.42 得到證實。同時δ1.76(H-14)與δ1.59 和δ1.13兩處都有相關(guān)偶合,H2-15 的化學(xué)位移得到證實。
圖7 化合物2 的DEPT 圖譜Fig.7 The DEPT spectrum of compound 2
H-15 應(yīng)與H-16 直接偶合,在1H-1H COSY 譜圖中,δ1.59 和δ1.13(H2-15)分別與δ1.39 和δ2.73有交叉,因此將δ1.39 和δ2.73 歸屬為H2-16,結(jié)合HSQC 譜圖將δ32.4 歸為C-16。將未歸屬的δ154.1季碳峰歸為C-3,δ20.8 仲碳峰歸屬為C-11,通過HSQC 譜 圖 將δ1.29 和δ1.52 歸 屬 為H2-11。在1H-1H COSY 中,δ0.77 (H-9) 與δ1.29 和δ1.52(H2-11)有交叉峰,證實H2-11 的化學(xué)位移,至此化合物2 所有的碳都得到歸屬。
化合物2 的1H NMR 譜中,低場的δ4.66 與化合物1 的氫譜圖對比,是17 位的羥基氫的化學(xué)位移。結(jié)合HMBC 譜圖,δ4.66 的氫與δ84.4(C-17)、δ32.4(C-16)和δ46.5(C-13)處的碳都有相關(guān)偶合,這也證明17 位的羥基氫的吸收峰。
在HMBC 譜中,δ10.47 處氫和δ154.1(C-3)碳相偶合,而δ10.39 氫與δ157.9(C-20)處相偶合,因此δ10.47 和δ10.39 這兩處分別是C-3 和C-20 肟羥基氫的化學(xué)位移,說明化合物2 含有3、20 位兩個肟基。
化合物2 的1H NMR 和13C NMR 數(shù)據(jù)全部得到歸屬,結(jié)果見表1。
實驗結(jié)果表明利用甾體原料17α-OH 黃體酮合成17α-OH-孕甾-4-烯-3,20-二肟方法簡便,反應(yīng)條件溫和,產(chǎn)物分離比較容易。利用核磁共振碳譜和氫譜對17α-OH-孕甾-4-烯-3,20-二肟進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,利用2D NMR 對其碳譜和氫譜數(shù)據(jù)進(jìn)行全歸屬和詳細(xì)的解析,為其他甾體二肟的合成、結(jié)構(gòu)分析做參考。
[1]Pritish C,Archana M D,Papori G,et al.Synthesis of some new steroidal [16α,17α -d]-isoxazolines[J].Steroid,2005,70(4):494-498.
[2]Mathew P L,Bertrand L,Simon P N,et al.Anti-cancer activities of novel D-ring modified 2-substituted estrogen-3-O-sulfamates [J].Journal of Steroid Biochemistry &Molecular Biology ,2005,94(1):239-251.
[3]Delphine S F,Gillian M A,Christian B,et al.E-ring modified steroids as novel potent inhibitors of 17β -Hydroxysteroid dehydrogenase type 1[J].Journal of Medical Chemistry,2005,48(18):5749-5770.
[4]Sikharulidze M I,Nadaraia.N Sh,Kakhabrishvili M L,et al.Synthesis and biological activity of several steroidal oximes[J].Chemistry of Natural Compounds,2010,46(3):493-493.
[5]Deive N,Rodriguez J,Jimenez C,et al.Synthesis of cytotoxic 6E -hydroximino -4 -ene steroids:structure/activity studies[J].J Med Chem,2001,44(16):2612-2618.
[6]田光輝,萊普輝,孫志鋒,等.環(huán)氧孕酮肟的合成及其抗菌活性[J].武漢大學(xué)學(xué)報,2012,58(1):45-48.
[7]王海英,葛文中.甾體肟的合成及抗腫瘤活性的研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報,2011,23(1):69-71.