劉懷阿， 蘇建坤， 劉 琴， 李 婷， 楊鐘靈， 蔣 歡，3

(1.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇 揚州 225007;2.南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，農(nóng)作物生物災害綜合治理教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095;3.重慶市涪陵區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所，重慶 涪陵 408000)

馬蹄蓮(Zantedeschia spp.)是天南星科馬蹄蓮屬多年生草本球根花卉植物，原產(chǎn)于南部非洲，被分為兩類［1-2］。一類為 Zantedeschia，如白花馬蹄蓮(Z.aethiopica)，該類植物地下莖為肉質(zhì)根狀，具有較強抗寒性，對軟腐病具有一定的耐性。另一類為Aestivae，常被稱為彩色馬蹄蓮，該類植物花色多樣，地下莖肉質(zhì)塊狀耐寒性較弱，需要休眠，易發(fā)細菌性軟腐?。?］。

引起馬蹄蓮細菌性軟腐病的病原菌主要為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種(Pectobacterterium carotovorum subsp.carotovorum，1988年前為 Erwinia carotovora subsp.carotovora，下文簡稱 Pcc)［4-9］。Pcc寄主范圍廣泛，包括馬蹄蓮、結(jié)球甘藍、胡蘿卜、黃瓜、辣椒、蕪青、萵苣和馬鈴薯等［10］。這種土傳兼性厭氧性細菌在馬蹄蓮生長期和種球貯藏期侵染。發(fā)病初期葉片退綠黃化，呈水浸狀壞死，隨后發(fā)病加重，出現(xiàn)軟腐，發(fā)出惡臭，嚴重時整個植株在幾天之內(nèi)死亡［3，11］。Pcc引起的軟腐病一直是植物病理學研究的熱點課題，特別是在其全基因序列公布后［12］，與其致病相關的研究更有所增加［13-14］。

植物病原菌的致病過程是病原菌與寄主相互作用的過程，該過程由一系列致病因子參與。為了研究根瘤菌與甘草之間的共生固氮機制，Cai等人［15］運用甘草種子浸提物誘導中慢生型天山根瘤菌結(jié)瘤基因的表達，從5 000多個轉(zhuǎn)座子插入突變株中獲得8株受寄主誘導的突變株，鑒定出了中慢生型天山根瘤菌和其宿主甘草在共生固氮結(jié)瘤早期的信號交流中發(fā)揮作用的基因，并且提出了根瘤菌的LysE系統(tǒng)和其宿主植物分泌物中刀豆氛酸的互作模型。

為探尋Pcc的致病相關基因在致病過程中與寄主之間的關系，本研究擬利用轉(zhuǎn)座子隨機插入法構(gòu)建Pcc突變體文庫，通過寄主白花馬蹄蓮的組織提取液誘導Pcc中某些基因的表達，篩選獲得受寄主誘導，且與致病性相關的突變株，進而對這些基因的功能進行研究，旨在為進一步研究Pcc的致病機制以及制定病害防控策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、引物、培養(yǎng)基與植物材料

胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種 Pcc菌株PccS1，由本實驗室分離和鑒定［6］。其他菌株與質(zhì)粒見表1，所需引物見表2。胡蘿卜軟腐果膠桿菌及其相關突變株均用2YT培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)。E.coli菌株用LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，試驗所需限制性內(nèi)切酶、連接酶和rTaq酶均購自TaKaRa公司。

表1 供試菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 試驗所用引物Table 2 The primers used in this study

白花馬蹄蓮(Zantedeschia aethiopica)、黃花馬蹄蓮(Z.elliotiana)均為本研究室引進品種，溫室栽培;大白菜(Brassica pekinensis)為南京市場銷售產(chǎn)品早熟五號。

白花馬蹄蓮(Z.aethiopica)組織提取液(ZaE)，參照Aretusa等［18］介紹方法制備。挑選長勢、大小一致的白花馬蹄蓮葉片10 g，75%酒精表面消毒，加入50 ml去離子水研磨，紗布過濾2次，取濾液，6 000 r/min、4℃離心10 min，離心 4～5次，取上清，用0.22 μm細菌過濾器過濾，得20%的葉片提取液，分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PccS1突變體文庫的構(gòu)建以及目的菌株的篩選

將PccS1在含利福平(Rif)100 μg/ml的2YT固體培養(yǎng)基上劃線，28℃下約17 h后，挑去單菌落在28℃、2YT液體培養(yǎng)基中，220 r/min振蕩，過夜培養(yǎng)后，按1∶100轉(zhuǎn)接到2YT(100 μg/ml Rif)液體培養(yǎng)基，28 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至 OD600為0.6 ～0.8，分裝至2 ml滅菌離心管，8 000 r/min離心，棄上清，用不含抗生素的2YT液體培養(yǎng)基漂洗3次，去除殘留抗生素，用100 μl液體2YT培養(yǎng)基懸浮，獲得受體菌;以E .coli SM10λpir(pJZ260，含有mariner轉(zhuǎn)座子，南京農(nóng)業(yè)大學生命科學院朱軍教授提供)為供體菌，制備方法與供體菌相同，但液體培養(yǎng)基中添加抗生素為氨芐青霉素(Amp)100 μg/ml和氯霉素(Cm)100 μg/ml。將滅菌濾膜(孔徑 0.22 μm，直徑25 mm)置于2YT平板，在每張濾膜上分別滴加25 μl受體菌和供體菌，充分混合，37℃培養(yǎng)1 h后，轉(zhuǎn)入28℃培養(yǎng)12～14 h。50 μl受體菌和供體菌分別滴加濾膜，作為對照。1 ml液體2YT培養(yǎng)基洗滌濾膜，洗滌液8 000 r/min離心3 min，適量2YT培養(yǎng)基懸浮菌體，分別涂布于2YT平板［含100 μg/m Rif+100 μg/ml Cm+40 μg/ml卡拉霉素(Km)+3%ZaE］，28℃下倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落，分別一一對應接種在100 μg/ml Rif+100 μg/ml Cm+40 μg/ml Km+3%ZaE(下文簡稱2YT-A)平板和100 μg/ml Rif+100 μg/ml Cm+40 μg/ml Km(下文簡稱2YT-B)平板上，只在2YT-A平板上能生長的菌株，可以初步確定該菌株為受白花馬蹄蓮組織液誘導、Km基因得到表達的突變株。

1.3 受馬蹄蓮組織提取液誘導的突變株生長曲線的測定

接種突變株(接種量1%)至兩瓶50 ml MMX液體培養(yǎng)基(40 μg/ml Km)中，一瓶加入 3%ZaE，而另一瓶加入相同體積的無菌水做對照，28℃、200 r/min培養(yǎng)。每隔4 h測定菌體濃度(OD600)。

1.4 轉(zhuǎn)座子插入位點的鑒定及序列分析

突變株、pUC19分別用SalⅠ酶切后，連接獲得重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在LB(100 μg/ml Cm)固體平板上篩選轉(zhuǎn)化子，挑選陽性克隆進行驗證后，用轉(zhuǎn)座子兩端引物(Km-1和137-1)進行測序并拼接。測序結(jié)果用 NCBI上的BLASTx進行序列比對。

1.5 ubiG缺失突變體和互補菌株的構(gòu)建及驗證

1.5.1 ubiG缺失突變體的構(gòu)建及驗證 設計引物，通過PCR從ubiG、ubiG上下游以及Km片段的5'端和3'端擴增得到 U1(367 bp)、U2(438 bp)和Km(1 514 bp)DNA片段。純化后分別用EcoRⅠ/HindⅢ、HindⅢ/KpnⅠ和KpnⅠ/XbaⅠ進行雙酶切，回收，連接自殺載體pEX18GM構(gòu)建重組載體，導入E.coli BW20676中獲得供體菌。供體菌與受體菌PccS1兩親結(jié)合，得到一次交換子，一次交換子220 r/min振蕩4 h，菌液涂布于含有10%蔗糖的2YT固體平板上篩選得到突變體。以UF1和UR2為上下游引物擴增突變株中2 319 bp的片段和野生型中1 525 bp的片段。

1.5.2 互補菌株的構(gòu)建及驗證 利用廣宿主載體pBBR1-MCS5構(gòu)建ubiG基因的互補載體。設計引物HUF和HUR從PccS1中擴增ubiG基因片段和其啟動子片段(1 315 bp)。HindⅢ和XbaⅠ雙酶切回收后與載體pBBR1-MCS5連接得到重組載體，導入E.coli BW20676中獲得供體菌，與受體菌△ubiG兩親結(jié)合，獲得互補菌株△ubiG(ubiG)。用載體上的引物GmF和GmR擴增互補菌株約500 bp的片段，以及引物HUF和HUR擴增目的片段，驗證互補菌株。

1.6 缺失突變株和互補菌株的表型及活性分析

1.6.1 致病性測定 將 PccS1、△ubiG和△ubiG(ubiG)分別在含有相應抗生素的液體2YT培養(yǎng)基中，28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)14～17 h，無菌水懸浮并調(diào)整OD600至0.6，取5μl接種于黃花馬蹄蓮(Z.elliotiana)和白花馬蹄蓮(Z.aethiopica)葉片和大白菜葉柄上(接種前用75%酒精表面消毒)。試驗重復3次，置于25℃保濕培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。

1.6.2 生長曲線測定 將PccS1、△ubiG和△ubiG(ubiG)分別在含有相應抗生素的液體2YT培養(yǎng)基中，28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)14～17 h，無菌水懸浮并調(diào)整OD600至0.6，然后按1∶100的比例接種于2TY培養(yǎng)基中，每小時測定1次菌液OD600值。試驗重復3次。

1.6.3 沉降性測定 將 PccS1、△ubiG和△ubiG(ubiG)分別于28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為2.0，取出后豎直靜置24 h，觀察各菌株的菌體狀態(tài)。試驗重復3次。

1.6.4 生物膜測定 主要參照Toole等［19］的方法，將PccS1、△ubiG和△ubiG(ubiG)分別于28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)14～17 h，無菌水懸浮并調(diào)整 OD600為1.0，按1∶100比例轉(zhuǎn)接到小試管中，28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為2.0，吸盡菌液，用等體積的無菌水清洗2次，加入等體積的1%結(jié)晶紫染色20 min，吸盡結(jié)晶紫，無菌水清洗3次，觀察試管壁上是否有一圈紫色物質(zhì)。用1 ml 90%乙醇溶解，575 nm測量吸光值。試驗重復3次。

1.6.5 抗生素耐受性測定 所用抗生素包括四環(huán)素、氯霉素、頭孢霉素、羧芐青霉素、壯觀霉素、硫酸鏈霉素、硫酸新霉素以及氨芐青霉素，均配制為100 mg/ml，制 備 抗 生 素 終 濃 度 分 別 為 5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml、60 μg/ml、70 μg/ml、80 μg/ml、90 μg/ml和 100 μg/ml的 2YT 平板培養(yǎng)基。若菌株抗性大于100 μg/ml，則再根據(jù)具體抗性濃度而設置抗生素終濃度。

將PccS1、△ubiG和△ubiG(ubiG)分別于28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)14～17 h，無菌水懸浮并調(diào)整OD600為1.0，各取2.5 μl接種于各濃度的抗生素平板上，28℃中培養(yǎng)24 h后觀察菌落的生長情況。

1.6.6 胞外酶活性檢測 蛋白酶檢測培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基中加入1%高溫滅菌的脫脂牛奶。參照Yi等［20］制備果膠酶酶和纖維素酶檢測培養(yǎng)基。

將待測菌株分別在含有相應抗生素的液體2YT培養(yǎng)基中，28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)14～17 h，無菌水懸浮并調(diào)至OD600為2.0，取2.5 μl分別接種于各檢測平板上，28℃培養(yǎng)48 h。通過觀察不同胞外酶檢測平板上降解圈的大小來判斷菌株胞外酶活性。在蛋白酶檢測平板上可直接觀察菌落周圍透明降解圈的大小。果膠酶平板的觀察:加入7.5%醋酸銅染色1 h。纖維素酶平板的觀察:先加入0.2%剛果紅染色20 min，再加入1 mol/L NaCl漂洗15 min，最后用1 mol/L HCl著色5 min，根據(jù)降解圈的大小比較突變菌株產(chǎn)生胞外酶的差異。

1.6.7 菌體形態(tài)和鞭毛觀察 PccS1和突變株△ubiG分別用含相應抗生素的2YT平板純化，28℃培養(yǎng)20 h，單菌落制成菌懸液，PTA負染，日立H-7650透射電鏡觀察菌體形態(tài)及鞭毛。

2 結(jié)果

2.1 彩色馬蹄蓮組織提取液誘導突變株(Km表達)的篩選

本研究中mariner轉(zhuǎn)座子上含有沒有啟動子的卡那霉素抗性基因(Km)，當它轉(zhuǎn)座插入到某個啟動子后面或基因的內(nèi)部，Km的表達就會受到該啟動子的調(diào)控。挑取在2YT-A平板上生長的單菌落分別點在2YT-A平板和2YT-B平板上。能生長的就是Km基因得到表達的突變株，即卡那霉素抗性基因插在組成型表達的基因內(nèi)或者是被ZaE誘導表達的基因內(nèi)。

通過此方法篩選獲得1株能夠誘導Km抗性基因表達的突變株，對突變株進行生長速率測定，發(fā)現(xiàn)突變株在添加Km的培養(yǎng)基和添加ZaE+Km的培養(yǎng)基中的菌體濃度(OD600)在生長20 h后發(fā)生明顯差異，突變體在未加ZaE的培養(yǎng)基中的OD600值持續(xù)在1.0左右，而在加入ZaE的培養(yǎng)基中可持續(xù)生長(圖1)。

圖1 馬蹄蓮組織提取液(ZaE)對突變株的誘導Fig.1 Induction of mutant by Zantedeschia aethiopica extraction

2.2 轉(zhuǎn)座子插入位點序列分析

通過亞克隆技術鑒定轉(zhuǎn)座子的插入位點。將測序所得序列拼接，找到1個720 bp的開放閱讀框(ORF)。Blast分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)座子插入位點位于輔酶Q氧甲基轉(zhuǎn)移合成酶(Ubiquinone biosynthesis O-methyltransferase)編碼基因ubiG。轉(zhuǎn)座子插在了該閱讀框的199 bp與200 bp之間。該基因全長720 bp，與 P.carotovorum subsp.carotovorum 菌株 PC1 有99%的同源性。

2.3 ubiG基因缺失突變體和互補菌株的構(gòu)建及驗證

2.3.1 突變體△ubiG的構(gòu)建及驗證 自殺重組質(zhì)粒pEXubiG經(jīng)EcoR I和Xba I雙酶切驗證，結(jié)果見圖2，兩個片段分別為載體pEX18GM和目的片段。驗證重組載體構(gòu)建成功后，通過兩親交配得到目標突變體。利用引物UF1和UR2對目標突變體PCR驗證，突變體可擴增獲得2 319 bp片段，野生株擴增獲得1 525 bp片段(圖3)。

圖2 重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Xba I雙酶切驗證Fig.2 Digestion of the recombinant plasmid with EcoR I and Xba I

圖3 缺失突變體用引物UF1和UR2進行PCR驗證Fig.3 PCR identification of the deletion mutants with primers UF1 and UR2

2.3.2 互補菌株的構(gòu)建及驗證 將ubiG基因和啟動子片段連接到載體pBBR1-MCS5上，得到重組載體。重組載體經(jīng)HindⅢ和Xba I雙酶切驗證(圖4)，導入突變株△ubiG，得到互補菌株△ubiG(ubiG)?；パa菌株經(jīng)引物GmF、GmR(約500 bp)和HUF、HUR(1 315 bp)驗證正確(圖 5)。

圖4 重組載體經(jīng)HindⅢ和Xba I雙酶切驗證Fig.4 Digestion of the recombinant vector with Hind Ⅲ and Xba I

圖5 △ubiG(ubiG)用引物 GmF、GmR和 HUF、HUR進行PCR驗證Fig.5 PCR identification of strain △ubiG(ubiG)with primers GmF，GmR and HUF，HUR

2.4 缺失突變株和互補菌株的表型及活性分析

2.4.1 致病性 致病性測定結(jié)果顯示，突變株在不同寄主上的致病性均減弱，從圖6可以得出黃花馬蹄蓮(Z.elliotiana)和白花馬蹄蓮(Z.aethiopica)上野生型的病斑面積為突變株的2倍左右，致病性減弱不明顯，而在大白菜上野生型的病斑面積為突變株的5倍左右。互補菌株使致病性在大白菜上有一定程度的恢復，病斑面積約為野生型的80%，而在黃化馬蹄蓮和白色馬蹄蓮上致病性恢復不明顯。

2.4.2 生長曲線 為了解ubiG基因缺失是否影響細胞的正常生長，測定了野生型菌株 PccS1、突變株△ubiG和互補菌株△ubiG(ubiG)在2TY液體培養(yǎng)基上的生長速率，并繪制了生長曲線，發(fā)現(xiàn)突變株在遲緩期的生長稍慢于野生型，野生型在4 h左右開始生長，而突變株在5 h開始生長。突變株在對數(shù)期的生長速率相對于野生型較平緩?；パa菌株沒有恢復野生型的生長速率，與突變株基本相似(圖7)。

圖7 突變株△ubiG在2YT培養(yǎng)基中的生長速率Fig.7 Growth rate of ubiG mutant strain in 2YT medium

2.4.3 沉降性 為研究ubiG基因的缺失是否影響PccS1的運動能力，測定了PccS1、△ubiG和△ubiG(ubiG)的沉降性。將濃度基本一致的菌株PccS1、△ubiG和△ubiG(ubiG)豎直放置于試管架上，室溫下靜置24 h后觀察發(fā)現(xiàn)，突變株△ubiG沉降速度明顯快于野生型PccS1和互補菌株△ubiG(ubiG)，△ubiG菌體聚集于試管底部，菌液上層澄清，相比之下，PccS1和△ubiG(ubiG)菌液渾濁，菌體均勻分散于培養(yǎng)基中。

2.4.4 生物膜 為研究ubiG基因缺失是否影響Pcc的生物膜形成能力，分別定性和定量測定了PccS1、△ubiG以及△ubiG(ubiG)的生物膜產(chǎn)生量。同時在紫外分光光度計575 nm下對生物膜的產(chǎn)生進行定量測定，結(jié)果見圖8?？梢钥闯?，△ubiG與PccS1相比，生物膜產(chǎn)量減少到野生型的1/2左右，互補菌株生物膜的產(chǎn)量稍低于野生型。

圖8 突變株△ubiG生物膜的定性和定量檢測Fig.8 Qualitative and quantitative detection of biofilm of ubiG mutant strain

2.4.5 抗生素耐受性 從不同濃度的抗生素平板上觀察發(fā)現(xiàn)，ubiG基因的缺失增強了PccS1對硫酸鏈霉素(Sm)和硫酸新霉素(Neo)的抗性，Sm對PccS1的最低抑菌濃度為20 μg/ml，而Sm對△ubiG的最低抑菌濃度為60 μg/ml，△ubiG對Sm的抗性是野生型菌株的3倍，互補菌株抗性同突變株。

Neo對PccS1的最低抑菌濃度同樣為20 μg/ml，但是對△ubiG的最低抑菌濃度為 550 μg/ml，△ubiG對Neo的抗性是野生型菌株的27.5倍，互補菌株抗性同突變株。

2.4.6 胞外酶 從3種胞外酶檢測培養(yǎng)基上觀察發(fā)現(xiàn)，突變株△ubiG在蛋白酶檢測平板上無降解水解圈，而在纖維素酶和果膠酶檢測平板上水解圈大小與野生型差異不明顯。互補菌株△ubiG(ubiG)對合成胞外蛋白酶能力沒有恢復。

2.4.7 菌體形態(tài)以及鞭毛觀察 在透射電鏡下觀察突變株的菌體形態(tài)及鞭毛(圖9)發(fā)現(xiàn)，ubiG基因突變株能夠正常形成4～6根周生鞭毛，與野生型沒有差異，菌體形態(tài)也與野生型無差異，都呈桿狀。

圖9 野生型PccS1和突變株△ubiG的鞭毛及菌體形態(tài)觀察Fig.9 Flagellum and cell shapes of PccS1 and △ubiG

3 討論

培養(yǎng)基中添加馬蹄蓮組織提取液，插入突變株生長明顯快于不添加寄主組織提取液的對照，說明寄主提取液中可能存在某種物質(zhì)能夠誘導轉(zhuǎn)座子插入基因的表達增強，也可能是因為寄主組織提取液提供突變株一個更好的生長環(huán)境，使得突變株在添加提取液后能夠更好的生長。所以要探究馬蹄蓮組織是如何誘導ubiG基因表達，還需要進一步研究。

ubiG基因的缺失減弱了PccS1對不同寄主的致病力，同時，又影響了菌株的正常生長，所以致病性的減弱可能是由于缺失突變株生長不良而引起的。ubiG基因的缺失還加快了菌體的沉降速率，表明菌體運動能力降低。運動性是Pcc中的重要致病因子，Mijan Hossain等［23］對 Pcc菌株 PC1 的 fiiC 和motA基因進行敲除后，對大白菜上的致病性減弱，其中fiiC基因缺失后，鞭毛消失，喪失運動性;而motA基因缺失，菌株雖喪失運動性，但鞭毛依然存在，說明Pcc鞭毛介導的是運動性而非鞭毛本身影響了病原菌對寄主的毒力。所以ubiG基因缺失導致運動能力的降低，可能是導致病原菌致病性減弱的原因。

ubiG基因缺失突變株對不同抗生素的耐受性結(jié)果表明，ubiG基因缺失增強了對硫酸鏈霉素和硫酸新霉素的抗性，特別是硫酸新霉素，突變株對其耐受水平是野生型的27.5倍。硫酸鏈霉素和硫酸新霉素都屬于氨基糖苷類抗生素，主要作用于細菌核糖體的30亞基，從而抑制細菌蛋白質(zhì)的合成，并破壞細胞膜的完整性。鏈霉素和新霉素是防治革蘭氏陰性細菌引起的植物病害的重要抗生素。隨著單一藥劑的長期大量使用，已經(jīng)引起了病原菌對鏈霉素的抗藥性［24］，但是還沒有報道過對硫酸新霉素產(chǎn)生抗藥性的植物病原細菌。細菌對抗生素產(chǎn)生耐受性的原因主要有:(1)減少藥物吸收或藥物在細菌體內(nèi)的積累;(2)細菌產(chǎn)生鈍化酶使藥物失活［25］。Yang等［26］在對Pcc各亞種鏈霉素抗性突變株的研究中，發(fā)現(xiàn)突變株的胞外多糖產(chǎn)量明顯增多，胞外多糖是細菌生物被膜形成所必需的，而生物膜是細菌耐藥性產(chǎn)生的重要機制之一，但是本研究發(fā)現(xiàn)ubiG突變株的生物膜產(chǎn)量比野生型少，故ubiG基因缺失突變株對兩種抗生素的抗性增強可能是其他原因引起。但本研究基因敲除插入了Km抗性基因，能夠引起突變株對鏈霉素和硫酸新霉素產(chǎn)生抗性，但是突變株對鏈霉素和硫酸新霉素的抗性存在較大差異，因此，ubiG基因缺失是否對鏈霉素和硫酸新霉素抗性產(chǎn)生有關，尚需進一步研究。

病原細菌的蛋白酶可能與提供病原菌蛋白質(zhì)合成所需氨基酸或者降解植物抗性相關蛋白質(zhì)有關，Pcc中則至少存在一種蛋白酶(PrtW)，prtW基因缺失嚴重影響病原菌的毒力［27］。本研究發(fā)現(xiàn)ubiG基因缺失導致突變菌株蛋白酶活力喪失，所以，可以推測ubiG基因缺失可能間接影響蛋白酶編碼基因的表達，進而影響Pcc的致病性。

突變株的互補菌株對大白菜的致病性菌體的沉降速率生物膜的產(chǎn)量能夠部分恢復，而其他表型恢復不明顯，可能與載體和病原菌基因組的遺傳表達系統(tǒng)之間存在差異相關。

綜上所述，利用寄主組織提取液并結(jié)合轉(zhuǎn)座子隨機插入法研究Pcc與寄主的互作是可行的。ubiG基因與Pcc致病相關的研究未見報道，本研究證實該基因與Pcc的毒力相關，它可能不直接參與致病，但在致病過程中起調(diào)控作用，通過影響菌株的運動能力以及胞外蛋白酶的活性間接影響致病性。

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