周洪波，林福來，鄭 甲，郭 寧，吳俊子，吳麗雙，邱冠周

（1. 中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院， 湖南 長沙 410083； 2. 生物冶金教育部重點實驗室， 湖南 長沙 410083）

β-1,4-D-甘露聚糖酶(endo-1,4-D-mannanase,EC 3.2.1.78) 能夠隨機(jī)催化水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖等中的β-1,4-甘露糖苷鍵，屬于半纖維素酶類[1]，它有著許多廣泛的應(yīng)用前景，例如紙漿漂白，降低咖啡提取物的粘度，提高飼料的營養(yǎng)價值和用于石油開采等[2]。隨著β-甘露聚糖酶的應(yīng)用越來越廣泛，其需求量也越來越大，為了提高β-甘露聚糖酶的產(chǎn)量，目前β-甘露聚糖酶已經(jīng)成功地在原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行異源表達(dá)。

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前研究比較清楚、應(yīng)用最廣、最有效的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。目前β-甘露聚糖酶已經(jīng)在畢赤酵母中獲得了成功表達(dá)，例如李松瑜[3]等構(gòu)建的β-甘露聚糖酶工程菌在畢赤酵母中獲得了成功表達(dá)，搖瓶發(fā)酵24 h，發(fā)酵上清液酶活可以達(dá)到343 U·mL-1，產(chǎn)酶蛋白量約為 1.0 mg·mL-1。

蛋白的降解是高密度發(fā)酵培養(yǎng)的一個主要問題[4]。許多報道表明通過降低溫度可以有效減少外源重組蛋白的降解，溫度控制策略能有效防止外源蛋白的降解[5-7]。溫度對畢赤酵母的影響主要是影響酵母細(xì)胞的生長速率，溫度過低抑制生長，畢赤酵母最適生長溫度為 28～30 ℃，但是對于外源蛋白的表達(dá)而言，溫度的影響是各種因素綜合表現(xiàn)的結(jié)果。越來越多的研究報道表明降低培養(yǎng)溫度可以提高外源重組蛋白的表達(dá)量，例如，Jin等[8]利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源豬干擾素-α，其表達(dá)產(chǎn)量在 20℃下可以達(dá)到5 g/L,是30 ℃培養(yǎng)下的1.6倍。

本文通過觀察不同溫度下β-甘露聚糖酶活力，并通過SDS-PAGA圖譜驗證了低溫有利于外源蛋白在發(fā)酵液中的積累。并且從不同溫度下的菌體活性，發(fā)酵液中蛋白酶活力，mRNA表達(dá)水平來解釋了溫度對于β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中表達(dá)的影響機(jī)制。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與設(shè)備

菌種：β-甘露聚糖酶重組畢赤酵母菌株。

培養(yǎng)基：YPD 液體培養(yǎng)基：蛋白胨 2%，酵母粉1%，葡萄糖 2%。

儀器與設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱（GHP-9050），熒光定量PCR儀（ABI 7000）, 垂直電泳槽(DYCZ-30)。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

一級種子搖瓶培養(yǎng)：從平板菌落中挑取菌落，于50 mL搖瓶中培養(yǎng)，搖瓶裝液量為10%，28 ℃，250 r/min條件下培養(yǎng)24 h達(dá)到菌體生長對數(shù)期。

搖瓶培養(yǎng)：按 1%的接種量，從一級搖瓶種子中，用移液槍吸取0.5 mL菌液，加入裝有50 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，平行三份，分別于30、26、22 ℃，250 r/min條件下培養(yǎng)。

1.2.2 測定方法

β-甘露聚糖酶酶活測定: 采用DNS法檢測β-甘露聚糖酶酶活[9]。細(xì)胞活性：采用亞甲基藍(lán)染色法[10]分析細(xì)胞活性?？偟鞍诐舛葴y定：利用考馬斯亮藍(lán)染色法測定總蛋白濃度。

SDS-PAGE檢測目的蛋白：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）的方法來檢測發(fā)酵液中的目的蛋白。

β-甘露聚糖酶基因mRNA表達(dá)水平檢測：利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測β-甘露聚糖酶基因mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對β-甘露聚糖酶重組畢赤酵母菌株生理特性的影響

2.1.1 溫度對重組菌株生長的影響

選取β-甘露聚糖酶重組畢赤酵母菌株先在 30℃下培養(yǎng)24 h，使得菌濃度迅速達(dá)到一定濃度，這是因為外源蛋白的表達(dá)量與菌體的生物量存在著正相關(guān)關(guān)系而且低溫菌體生長慢。然后再改變溫度為30、26、22 ℃這 3種培養(yǎng)條件下進(jìn)行外源β-mannanase蛋白的表達(dá)，考察溫度對β-甘露聚糖酶重組畢赤酵母菌株生長的影響。實驗結(jié)果（圖1）顯示：重組畢赤酵母預(yù)先30 ℃培養(yǎng)24 h之后，再分別在30、26、22 ℃這3種條件下繼續(xù)培養(yǎng)其表現(xiàn)出溫度越低生長會稍微慢些，但區(qū)別不是很大，而且在不同溫度下最終達(dá)到的菌濃度都差不多一致。說明了當(dāng)重組菌株培養(yǎng)24 h之后進(jìn)入生長對數(shù)中期后溫度的降低對生長的影響不大。

圖1 重組菌株分別在30、26、22 ℃培養(yǎng)條件下的生長曲線Fig.1 The growth curve of recombinant stain respectively at 30,26,22 ℃

2.1.2 溫度對畢赤酵母重組菌株存活率的影響

選取了培養(yǎng) 80 h的樣品通過亞甲基藍(lán)染色法來測定細(xì)胞的活性，考察不同培養(yǎng)溫度對畢赤酵母重組菌株存活率的影響，結(jié)果如圖2所示：隨著溫度的降低，重組菌株細(xì)胞存活率不斷提高，重組菌株的細(xì)胞存活率從 30 ℃下的 40%增加到了 22 ℃下的90%。

圖2 不同溫度下重組畢赤酵母細(xì)胞存活率Fig.2 Cell activity of recombinant Pichia pastoris at different culture temperatures

這一結(jié)果表明了溫度的降低可以很大程度上減少了細(xì)胞的死亡，從而減少死亡細(xì)胞的裂解導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白酶的釋放到發(fā)酵液中，最終減少外源β-mannanase蛋白的降解，使得目的蛋白β-mannanase酶活在低溫下后期發(fā)酵過程中得到積累提高。這與很多文獻(xiàn)報道相符，例如 Wang等[7]報道降低誘導(dǎo)溫度可以提高聚半乳糖醛酸裂解酶在畢赤酵母中的表達(dá)量。溫度控制策略是高密度發(fā)酵培養(yǎng)時有效防止外源目的蛋白降解的策略之一。

2.2 溫度對β-甘露聚糖酶重組畢赤酵母菌株表達(dá)β-mannanase的影響

2.2.1 溫度對重組菌株生長的影響

通過檢測β-mannanase酶活變化曲線來表征溫度對β-mannanase表達(dá)的影響。結(jié)果如圖3所示：在培養(yǎng)至33 h之前，重組畢赤酵母菌株在不同培養(yǎng)溫度下所表達(dá)出的酶活水平都差不多一致；當(dāng)繼33 h之后繼續(xù)培養(yǎng)可以發(fā)現(xiàn)重組畢赤酵母菌株其β-mannanase酶活水平隨著溫度的降低而得到提高；從圖3中可清楚的發(fā)現(xiàn)在30 ℃下重組菌株在后期發(fā)酵過程中酶活水平有顯著降低，從最高134 U/mL下降到61 U/mL；而在26 ℃的條件下重組菌株在后期發(fā)酵過程中酶活水平幾乎沒有降低；當(dāng)培養(yǎng)溫度降低至 22℃的時候重組菌株在后期發(fā)酵過程中酶活水平有著顯著的繼續(xù)積累增加，從 33 h的 123 U/mL增加到307 U/mL。這些結(jié)果說明了溫度的降低可以減少后期發(fā)酵過程中外源蛋白的降解，使得外源蛋白表達(dá)量得到繼續(xù)積累。溫度不僅影響著外源蛋白的降解，還影響著外源蛋白的合成等。

圖3 不同溫度對重組菌株β-mannanase酶活的影響。Fig.3 The effect of temperature on β-mannanase activity in recombinant strain

圖4 不同溫度下重組菌株總蛋白表達(dá)情況Fig.4 The effect of temperature on the expression of total protein in recombinant strain

2.2.2 溫度對重組菌株總蛋白表達(dá)量的影響

由于畢赤酵母宿主分泌到發(fā)酵液中的自身蛋白質(zhì)的量很少，發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)絕大部分是外源蛋白，所以通過檢測發(fā)酵上清液中的總蛋白含量可以初步表征目的蛋白的產(chǎn)量。通過測定重組菌株在不同培養(yǎng)溫度下發(fā)酵上清液中的總蛋白變化曲線，結(jié)果如圖4所示重組畢赤酵母菌株總蛋白的含量隨著培養(yǎng)溫度的降低而顯著增加，重組菌株總蛋白量從30 ℃下的 187 mg·L-1增加到 22 ℃下的 277 mg·L-1。

2.2.3 SDS-PAGE分析不同溫度下重組菌株目的蛋白的表達(dá)情況

通過SDS-PAGE我們直接從目的蛋白的含量來表明溫度對外源重組蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果如圖 5所示：在圖5(A)中30 ℃培養(yǎng)條件下發(fā)酵后期如60、72、84 h即5、6、7號泳道可以清楚發(fā)現(xiàn)β-mannanase目的蛋白被降解的很嚴(yán)重，SDS-PAGE幾乎檢測不到β-mannanase目的蛋白，這與圖3中30 ℃下酶活的變化趨勢一致；在圖 5(B)中 26 ℃培養(yǎng)條件下發(fā)酵后期如60、72、84 h即5、6、7號泳道 SDS-PAGE仍能檢測到目的蛋白， β-mannanase目的蛋白存在著稍微降解的現(xiàn)象，這與圖3中26 ℃培養(yǎng)下酶活的變化曲線相一致；在圖 5(C)中 22 ℃培養(yǎng)條件下發(fā)酵后期如 60、72、84 h即 5、6、7號泳道SDS-PAGE檢測到目的蛋白仍有少量增加，這與圖3中22 ℃培養(yǎng)下酶活的變化曲線相一致。

圖5的結(jié)果說明了隨著溫度的降低發(fā)酵液中目的蛋白量的降解減少使得目的蛋白可以繼續(xù)積累增加，酶活得以繼續(xù)提高。

圖5 不同溫度下β-mannanase目的蛋白表達(dá)情況Fig.5 The effect of temperature on the expression of β-mannanase protein

這里主要可能是因為隨著溫度的降低，減少了外源目的蛋白的在發(fā)酵液中被降解的現(xiàn)象[6]。另外可能也是因為溫度的降低導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平的降低從而導(dǎo)致合成速率的降低，使得蛋白合成速率與分泌速率相協(xié)調(diào)，從而減少 ER Stress、UPR，protein degradation 等[11,12]。

2.2 溫度對重組菌株發(fā)酵液中蛋白酶活力的影響

從 2.2.3小節(jié)結(jié)果說明了溫度的降低使得目的蛋白在發(fā)酵后期降解減少，為了具體說明溫度的變化，是改變了發(fā)酵液中蛋白酶活力，我們通過紫外光譜法[13]測定了80 h樣品的發(fā)酵液中的蛋白酶活力在不同溫度下的差別，酶活定義為1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位，以U·mL-1表示，結(jié)果如圖6所示：隨著溫度的降低，發(fā)酵上清液中的蛋白酶活力也隨著顯著降低，如 30 ℃時候蛋白酶活力為405 U·mL-1而26 ℃和22 ℃的蛋白酶活力則分別降至210和66 U·mL-1。從這結(jié)果我們可以明顯發(fā)現(xiàn)溫度的降低有利于蛋白酶活力的顯著降低，這可能主要是因為：隨著溫度的降低，細(xì)胞存活率越高（圖2），減少了細(xì)胞死亡后內(nèi)源性蛋白酶的釋放；溫度的降低同時也降低了內(nèi)源性蛋白酶的合成速率；溫度的降低同時較少了目的蛋白過量表達(dá)導(dǎo)致ER Stress、UPR等造成內(nèi)源蛋白酶合成的增加以降解胞內(nèi)錯誤折疊或者未分泌的蛋白；另外溫度的降低也有可能降低了發(fā)酵液酶活的比活力，使得降解目的蛋白的現(xiàn)象得到減輕。

圖6 不同溫度下蛋白酶活力差異：橫坐標(biāo)表示為不同的培養(yǎng)溫度分別為30、26、22 ℃。Fig.6 The effect of temperature on the protease,X-axis respectively representing culture temperature of 30, 26, 22℃

2.2 real-time qPCR分析不同溫度下重組菌株β-mannanase mRNA表達(dá)情況

有文獻(xiàn)報道溫度的降低可以降低蛋白的合成速率，從而降低外源蛋白的折疊負(fù)擔(dān)、減少ER Stress和UPR反應(yīng)等[14]，為了分析溫度的作用機(jī)制，我們分析其不同溫度下的β-mannanase mRNA表達(dá)差異，結(jié)果如圖 7所示：隨著表達(dá)溫度的降低，β-mannanase mRNA表達(dá)量也隨著降低，而且溫度越低，β-mannanase mRNA表達(dá)量降低得越多，例如β-mannanase mRNA表達(dá)量從培養(yǎng)溫度30 ℃變?yōu)?6 ℃和22 ℃后分別降低了0.44和1.58。這個結(jié)果說明了溫度的降低通過減少目的基因的轉(zhuǎn)錄水平，使得外源β-mannanase蛋白合成速率得以降低從而使得蛋白能夠來得及正確折疊并與蛋白分泌速率協(xié)調(diào)；減少蛋白正確折疊和分泌的負(fù)擔(dān)，隨著錯誤折疊、未折疊、未釋放的胞內(nèi)蛋白的減少，ER Stress，UPR等反應(yīng)也隨著減少；最后使得外源目的蛋白的表達(dá)量得以增加。

圖7 不同溫度下重組畢赤酵母菌株β-mannanase mRNA表達(dá)差異Fig.7 The effect of temperature on the expression of β-mannanase mRNA

3 結(jié) 論

在培養(yǎng)溫度分別為 30、26、22 ℃這三種不同溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，考察了溫度對β-甘露聚糖酶重組畢赤酵母菌株生理及目的蛋白表達(dá)的影響，并初步研究了溫度的作用機(jī)制得到了以下結(jié)論：

（1）當(dāng)重組菌株培養(yǎng)24 h進(jìn)入生長對數(shù)中期后，溫度的降低對菌體的生長速率影響不大，且最終菌濃度也差異不大。

（2）溫度的降低顯著的提高了重組菌株的細(xì)胞存活率：較高培養(yǎng)溫度下發(fā)酵后期的細(xì)胞存活率顯著降低，而在低溫培養(yǎng)下發(fā)酵后期細(xì)胞仍能保持很高的存活率。

（3）發(fā)酵液中的總蛋白含量都隨著溫度的降低而增加。在溫度較高的培養(yǎng)條件下，重組菌株其β-mannanase酶活力在發(fā)酵后期有顯著降低，而在低溫培養(yǎng)下重組菌株β-mannanase酶活力在發(fā)酵后期能繼續(xù)增加；通過SDS-PAGE分析表明了較高溫度培養(yǎng)下目的蛋白在發(fā)酵后期被降解嚴(yán)重，而在低溫培養(yǎng)下目的蛋白在后期仍能繼續(xù)積累。

（4）溫度的降低是通過降低了發(fā)酵液中的蛋白酶活力的作用機(jī)制使得目的蛋白的降解減少。

（5）溫度的降低減少了目的蛋白 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，使得外源蛋白合成速率得以降低從而與蛋白分泌速率相協(xié)調(diào)等；最后使得外源目的蛋白的表達(dá)量得以增加。

［1］吳襟，何秉旺. 微生物β-甘露聚糖酶[J]. 微生物學(xué)通報, 1999,26(2):134-136.

［2］Dhawan S KJ. Microbial mannanases:an overview of production and applications[J]. Crit Rev Biotechnol Lett, 2007, 27(2):197-216.

［3］李松瑜，陳小玲，王軍軍，曹云鶴，董冰.硫色曲霉β甘露聚糖酶在畢赤酵母中的組成型分泌表達(dá)[J]. 生物技術(shù)通訊, 2009, 20:12-14.

［4］Cereghino J L, Cregg J M. Heterologous protein expression in the methylotrophicyeastPichia pastoris[J]. FEMS Microbiology Reviews,2000, 24(1):45-66.

［5］Zhu T, You L, Gong F ,et al. Combinatorial strategy of sorbitol feeding and low-temperature induction leads to high-level production of alkaline β-mannanase inPichia pastoris[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2011, 49(23):407-412.

［6］Li Z. Low-Temperature Increases the Yield of Biologically Active Herring Antifreeze Protein inPichia pastoris[J]. Protein Expression and Purification, 2001, 21(3):438-445.

［7］Wang Y, Wang Z, Xu Q ,et al. Lowering induction temperature for enhanced production of polygalacturonate lyase in recombinantPichia pastoris[J]. Process Biochemistry, 2009, 44(9):949-954.

［8］Jin H, Liu G, Dai K ,et al. Improvement of porcine interferon-alpha production by recombinantPichia pastorisvia induction at low methanol concentration and low temperature[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2011,165(2):559-571.

［9］Yang P, Li Y, Wang Y ,et al. A Novel β-mannanase with High Specific ActivityfromBacillus circulansCGMCC1554: Gene Cloning,Expression and Enzymatic Characterization[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2009, 159(1):85-94.

［10］Wu J-M, Fu W-C. Intracellular co-expression of Vitreoscilla hemoglobin enhances cell performance and β-galactosidase production inPichia pastoris[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2012,113(3):332-337.

［11］Yoshida H. ER stress response, peroxisome proliferation, mitochondrial unfolded protein response and Golgi stress response[J]. IUBMB Life,2009, 61(9):871-879.

［12］Resina D, Bollok M, Khatri NK ,et al. Transcriptional response ofP.pastorisin fed-batch cultivations to Rhizopus oryzae lipase production reveals UPR induction[J]. Microb Cell Fact, 2007, 6(1):21.

［13］張寒俊, 楊國燕. 紫外光譜法定量測定不同種蛋白酶活性的研究[J]. 糧食與飼料工業(yè), 2004(9):44-45.

［14］Dragosits M, Stadlmann J, Albiol J ,et al. The Effect of Temperature on the Proteome of RecombinantPichia pastoris[J]. Journal of Proteome Research, 2009, 8(3):1380-1392.