郭嫦娟 廖 濤 柳 明 謝松光
(1.中國科學(xué)院水生生物研究所, 中國科學(xué)院水生生物多樣性與保護重點實驗室, 武漢430072; 2.中國科學(xué)院大學(xué),
北京 100049; 3.湖北省環(huán)境科學(xué)研究院, 武漢 430072; 4.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所, 武漢430064;5.中國科學(xué)院水生生物研究所淮安研究中心, 淮安223002)
環(huán)境雌激素(Environmental estrogens, EEs)是指干擾生物體內(nèi)源激素的合成、分泌、運輸、結(jié)合和代謝等過程的外源性化學(xué)物質(zhì)[1]。我國主要河流水系及沿海地區(qū)水體均不同程度受到環(huán)境雌激素的污染。多氯聯(lián)苯(PCBs)、壬基酚、雙酚 A、鄰苯二甲酸酯類等有機化工原料類一般在南方水體檢出率較高, 有機氯農(nóng)藥和生活用水排放是這些環(huán)境雌激素的主要來源[2]。環(huán)境雌激素對生態(tài)環(huán)境和人類健康的影響已受到社會的廣泛關(guān)注。
大量實驗室毒性實驗證明, 環(huán)境雌激素影響魚類的生長和繁殖[3—5], 這種個體水平的影響可能進一步影響魚類的種群動態(tài)。然而有關(guān)自然水體中環(huán)境雌激素的生物學(xué)效應(yīng)研究還很少。(Hemiculter Leucisculus)隸屬于鯉形目(Cyprinidae)、鯉科(Cyprinidae)、屬, 是生活于水體中上層的小型魚類, 在我國分布廣泛[6]。分批產(chǎn)卵, 繁殖季節(jié)為4—8月, 5—6月為盛季。本文選擇湖北省境內(nèi)四湖總干渠, 比較環(huán)境雌激素不同濃度江段繁殖群體的生物學(xué)特征, 為評價環(huán)境雌激素對魚類的影響效應(yīng)提供自然水體的證據(jù)。
四湖總干渠源于湖北荊州地區(qū), 經(jīng)潛江、監(jiān)利、洪湖至新灘口匯入長江, 全長100多km[7]。沿途城鎮(zhèn)生活污水、工業(yè)廢水和農(nóng)田用水排入總干渠[8]。總干渠中沒有魚類放養(yǎng)和漁業(yè)捕撈。
采樣在 A、B、C三個河段進行。其中 A段(30°21′49″N/112°30′12″E)離源頭較近, 水質(zhì)良好; B段(30°11′09″N/112°36′09″E)位于一個農(nóng)藥廠排污口下方; C 段(30°03′24″N/112°54′21″E)位于某城鎮(zhèn)排污口下方。
波恩氏液(苦味酸飽和水溶液∶甲醛∶冰醋酸為 15∶5∶1); 肝素鈉溶液(用無菌水配成 1 mg/mL的濃度, 4℃保存); 5%甲醛溶液, 無水乙醇, 濃H2SO4(上海國藥); 雌激素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司); 色譜分析中的乙酸乙酯、甲醇、正己烷為農(nóng)藥級, 乙腈為色譜純。
電子天平 (0.001 g)(SHIMADZU- BL-320H)、GCMS(Agilent 7890A-5975C); Oasis HLB柱(Waters)、光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX51)、解剖鏡(OLYMPUSSZX16)、輪轉(zhuǎn)式切片機(LEICA -RM2235) 。
采樣于2009年6月19日和20日進行, 采用流刺網(wǎng)(長: 17 m, 寬 1 m, 網(wǎng)目: 2.0 cm)采集繁殖群體, 每個采樣點采集30尾以上。樣品采集后立即置于冰塊中保存, 帶回實驗室后測定標(biāo)準(zhǔn)體長(Standard length, SL, 0.1 mm)、稱體重(Body weight,BW, 0.01 g); 將腹部剖開, 觀察性腺, 確定性別和性腺發(fā)育狀況; 選擇性腺發(fā)育成熟雌魚, 分離部分卵巢, 稱重后固定于5%的福爾馬林溶液中, 在解剖鏡下測定卵徑; 取出肝臟、稱重(Liver weight, LW,0.001 g), 肝體指數(shù)(HSI)采用以下公式計算:
取部分肝臟和精巢組織, 在波恩氏液中固定12—24h后, 轉(zhuǎn)入70%乙醇溶液中保存, 用于組織切片和觀察。切片時依次采用乙醇梯度濃度脫水, 二甲苯透明, 石蠟包埋, 切片, 烘片, 二甲苯脫蠟、系列乙醇復(fù)水, 蘇木精—伊紅染色, 乙醇脫水、二甲苯透明, 中性樹膠封片, 在顯微鏡下觀察并拍照。
魚類采集同時用采水器采集表層水樣 3 L, 現(xiàn)場用濃硫酸固定, 采用0.45 μm濾膜過濾, 用濃硫酸將pH調(diào)為3左右, 保存于4℃, 48h內(nèi)進行環(huán)境雌激素分析。測定時采用固相萃取方法對樣品進行濃縮分離, 采用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用 GC-MS的方法測定水樣中環(huán)境雌激素濃度[9]。
采用嵌套方差分析(Nested ANOVA)檢驗不同樣點間卵徑差異顯著性。采用雙因子方差分析(Twoway ANOVA)和最小顯著差數(shù)法(LSD)檢驗不同樣點、性別的HSI的差異顯著性。顯著性檢驗的顯著水平為P<0.05。統(tǒng)計分析采用 STATISTICA 6.0進行。
A河段水樣中沒有檢測出環(huán)境雌激素, B、C兩河段水樣中均檢測出壬基酚和雙酚A兩種環(huán)境雌激素, B、C兩河段間兩種污染物濃度均無顯著性差異(表 1)。
樣點對卵徑存在顯著的影響(Nested ANOVA,P<0.05), 多重比較表明A樣點卵徑平均值顯著大于B、C樣點, B、C樣點間卵徑平均值差異不顯著(表1)。
采樣點和性別對HSI均存在顯著差異(two-way ANOVA)。A樣點雌性和雄性個體的HSI均顯著低于B、C樣點(P<0.05); 三樣點中雌性個體的肝體指數(shù)均顯著高于雄性個體(P<0.05)(表1)。
表1 湖北四湖總干渠不同采樣江段(A、B、C)環(huán)境雌激素水平和繁殖群體的生物學(xué)特征Tab.1 The levels of environmental estrogen in the water and the reproductive characteristics of Hemiculter leucisculus at the three sampling sections (A, B and C) in the Main Irrigation Channel of the Four-lake area in Hubei Province
表1 湖北四湖總干渠不同采樣江段(A、B、C)環(huán)境雌激素水平和繁殖群體的生物學(xué)特征Tab.1 The levels of environmental estrogen in the water and the reproductive characteristics of Hemiculter leucisculus at the three sampling sections (A, B and C) in the Main Irrigation Channel of the Four-lake area in Hubei Province
注: 同一行中平均數(shù)上標(biāo)小寫英文字母不同, 表示差異顯著(P<0.05); 同一列中肝體指數(shù)平均數(shù)上標(biāo)大寫英文字母不同, 表示雌雄個體間差異顯著(P<0.05)Note: Means in a row with different superscripts of lower letlers are significantly different from each other (P<0.05); Means of Hepato somatic Index in a column with different superscripts of capital letters are significantly different from each other (P<0.05)
A B C雙酚 A(μg/L) Bisphenol A — 7.30±1.91 3.15±1.11環(huán)境雌激素水平Environmental estrogen level 壬基酚(μg/L) Nonylphenol — 12.84±3.49 18.12±2.84雌性個體百分比(%) Female percentage 38.02 58.93 61.11卵徑(mm) Egg diameter 0.67±0.08a 0.50±0.05b 0.51±0.04b肝體指數(shù)(♀) Hepatosomatic Index 1.44±0.94aA 2.56±0.57bA 2.70±0.44bAimages/BZ_324_259_2724_293_2754.png繁殖群體生物學(xué)指標(biāo)Reproductive characteristics肝體指數(shù)(♂) Hepatosomatic Index 0.95±0.54aB 1.40±0.58bB 1.68±0.48bB
圖1 四湖總干渠不同江段肝臟組織切片顯微照片F(xiàn)ig.1 The liver histological pictures of Hemiculter leucisculus from different sections of the Main Irrigation Channel of the Four-lake area in Hubei Province
四湖總干渠源頭A江段水體未檢測出環(huán)境雌激素, 而B、C兩江段主要含有壬基酚和雙酚A, 兩種污染物總濃度均在20 μg/L左右。與A江段相比, B、C江段繁殖群體中雌性個體的比例明顯較高, 卵粒較小; 雄性個體精巢中空增大, 結(jié)締組織壞死或斷裂, 精原細(xì)胞和精子細(xì)胞密度低; 肝體指數(shù)增大、肝組織出現(xiàn)大量空泡, 肝細(xì)胞密度降低、細(xì)胞核不明顯等特點。壬基酚和雙酚A等一類污染物已經(jīng)被證明具有顯著雌激素活性[10,11]。由于這些環(huán)境雌激素化學(xué)結(jié)構(gòu)與魚體內(nèi)生理合成的雌激素十分相似,可以與體內(nèi)雌激素受體結(jié)合, 影響相關(guān)內(nèi)源雌激素的合成、釋放、輸送、代謝、結(jié)合、作用或消除過程, 進而影響魚類的早期生長發(fā)育、性別分化、繁殖等[12,13]。雙酚A對斑馬魚的生殖有明顯的抑制作用, 而壬基酚和雙酚A具有協(xié)同效應(yīng)甚至中斷生殖行為[14]。B、C江段水體中壬基酚和雙酚 A濃度較高可能是導(dǎo)致繁殖群體生物學(xué)特征改變的重要原因。
水體中的環(huán)境雌激素能夠影響魚類性別決定過程, 對魚類產(chǎn)生明顯的雌性化效應(yīng), 改變魚類個體內(nèi)源激素表達(dá)水平, 從而引起種群性比改變。如英國調(diào)查報告表明, 生活在工廠排污河流的石斑魚發(fā)生了嚴(yán)重的雌性化現(xiàn)象[15], 在諾??丝さ陌瑺柡佑^測點, 接受調(diào)查的雄性石斑魚 60%出現(xiàn)了雌性化的特征, 雌性石斑魚比例顯著高于對照點[16]。在本研究中B、C江段繁殖群體的雌性個體比例較高可能與該江段中壬基酚和雙酚A的雌激素效應(yīng)相關(guān), 與以上文獻報道結(jié)果一致。
精巢是環(huán)境雌激素可以直接產(chǎn)生作用的靶器官。Bjerselius,et al.[17]和Gimeno,et al.[18]分別發(fā)現(xiàn)雌激素暴露下的雄性鯽魚和雄性鯉魚都會產(chǎn)生精子數(shù)量下降, 甚至沒有精液的現(xiàn)象。Jobling,et al.發(fā)現(xiàn)暴露在壬基酚中的虹鱒雄性生殖腺的生長受抑制[19]。雙酚A對斷乳期F1雄性子代大鼠生殖和發(fā)育有影響, 可能導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡增強, 增殖減慢, 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)受阻[20]。隨著環(huán)境雌激素濃度的增加,有可能使動物精巢中的一些細(xì)胞凋亡或者壞死的速度增加[21]。在本研究中環(huán)境雌激素污染物濃度較高的 B、C江段精巢組織結(jié)構(gòu)破壞與以上環(huán)境雌激素效應(yīng)一致。
進入生物體內(nèi)的壬基酚和雙酚A必須通過肝臟的代謝才能排除體外, 在內(nèi)分泌干擾物的刺激下,混合功能氧化酶等肝臟解毒酶的誘導(dǎo)效應(yīng)致使肝細(xì)胞腫大, 肝臟增大[22]。劉萍發(fā)現(xiàn)暴露于壬基酚、雙酚A、辛基酚和17β-雌二醇這四種化合物中的金魚HSI較對照組顯著升高[23]。而 B、C點肝臟細(xì)胞腫大, 核萎縮變形, 細(xì)胞空泡化以及局部肝組織壞死, 與環(huán)境雌激素作為外源異生物質(zhì)在肝中的代謝密切相關(guān)。
雖然已經(jīng)有很多受控實驗證明環(huán)境雌激素對魚類繁殖的影響, 但野外原位實驗直接證據(jù)還較少。本研究顯示在自然環(huán)境中, 環(huán)境雌激素濃度較高的水體, 魚類繁殖群體的繁殖生物特征顯著改變, 可能導(dǎo)致魚類精子和卵子質(zhì)量降低、繁殖成功率下降等, 從而影響魚類種群數(shù)量和結(jié)構(gòu)。很多天然水體都受到環(huán)境雌激素不同程度的污染, 如我國黃河口表層水體壬基酚平均值為47.5 ng/L[25], 珠江三角洲河段為 0.02—0.165 μg/L[26], 北黃海近岸濃度為15.13—762.73 ng/L[27]。有關(guān)環(huán)境雌激素污染物對魚類種群動態(tài)的影響需要通過研究環(huán)境雌激素污染水體相關(guān)魚類的種群動力學(xué)特征進一步闡述。
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