牛海濱，鄭玉林，萬 平，杜 雯，胡佳英，胡鵬亭

(上海新亞藥業(yè)有限公司，上海 201203)

萬古霉素是由東方擬無枝酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種糖肽類抗生素，由美國禮萊公司開發(fā)，1958年獲FDA批準(zhǔn)上市［1］。萬古霉素一直被國際抗生素專家譽(yù)為“人類對付頑固性耐藥菌株的最后一道防線”，通常不作為一線抗菌藥物應(yīng)用，只在常用抗菌藥物無效時才應(yīng)用。20世紀(jì)80年代隨著β-內(nèi)酰胺類抗生素的大量使用，由甲氧西林耐藥金葡球菌(MRSA)所引起的感染逐漸流行，萬古霉素是臨床上用于治療由MRSA引起的嚴(yán)重感染疾病的重要藥物，越來越引起人們的重視，應(yīng)用日漸增多。我公司在引進(jìn)萬古霉素發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，結(jié)合公司實(shí)際條件消化吸收再創(chuàng)新，經(jīng)過充分調(diào)研分析，選擇性的對工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)，獲得了較好的發(fā)酵效價和生產(chǎn)效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 上海新亞藥業(yè)有限公司菌保中心實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①斜面培養(yǎng)基:葡萄糖1.0%，麥芽抽提物0.5%，酵母粉0.3%，蛋白胨1.5%，瓊脂2.0%，消前pH 7.2±0.2，121℃ 20 min;②一級種培養(yǎng)基:酵母粉0.3%，麥芽抽提物0.6%，蛋白胨1.5%，葡萄糖2.0%，消前pH(7.4±0.2)，121℃ 20 min;③二級種培養(yǎng)基:豆粕0.8%，大豆粉0.5%，碳酸鈣0.3%，淀粉3%，消前pH(7.7±0.2)，121℃ 20 min;④發(fā)酵培養(yǎng)基:大豆粉2.6%，豆粕1.8%，氯化鈉0.2%，碳酸鈣0.5%，葡萄糖2.5%，淀粉3%，消前pH(7.5±0.2)，121℃ 20 min。

1.1.3 儀器設(shè)備 超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、振蕩搖床等。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)與發(fā)酵 斜面培養(yǎng):冷凍管菌種經(jīng)分離純化后接種于斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)5 d。一級種子液培養(yǎng):一級種培養(yǎng)基配制滅菌后，取新鮮培養(yǎng)好的菌種斜面，在無菌條件下，用無菌接種鏟取一塊菌種培養(yǎng)物，接入搖瓶一級種培養(yǎng)基，于28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。二級種子液培養(yǎng):二級種培養(yǎng)基配制滅菌后，取培養(yǎng)好的一級種培養(yǎng)液，在無菌條件下，吸取定量20 mL接入搖瓶二級種培養(yǎng)基，于28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基配制滅菌后，取培養(yǎng)好的二級種培養(yǎng)液，在無菌條件下，吸取定量25 mL接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，于28℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。

1.2.2 效價測定 采用高效液相分析HPLC法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 碳源濃度的確定(葡萄糖、淀粉) 根據(jù)單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)酵培養(yǎng)基中其他成分保持不變，只改變葡萄糖的濃度，選擇不同的濃度水平，考察葡萄糖因素對發(fā)酵結(jié)果的影響，確定最優(yōu)的葡萄糖濃度。同樣確定最優(yōu)的淀粉濃度。以試驗(yàn)的最高效價為100%，其他效價與之相比較作為相對效價，以相應(yīng)的碳源濃度為X軸，相對效價為Y軸作圖，如圖1、圖2所示。以葡萄糖、淀粉作為碳源有利于萬古霉素菌體發(fā)酵［2-3］。由圖1、2可見，葡萄糖濃度為2.0%、淀粉濃度為2.0%時，萬古霉素發(fā)酵效價水平最高。其中葡萄糖濃度在2.0%～3.0%時對發(fā)酵水平影響較小，淀粉濃度大于2.0%時，對發(fā)酵效價影響較小，在實(shí)際生產(chǎn)中配制培養(yǎng)基時應(yīng)注意應(yīng)用。確定最優(yōu)的碳源濃度葡萄糖為2.0%、淀粉為2.0%。

圖1 葡萄糖對萬古霉素發(fā)酵效價的影響Fig.1 Effect of the glucose concentration on the fermentation titer of vancomycin

圖2 淀粉濃度對萬古霉素發(fā)酵效價的影響Fig.2 Effect of the starch concentration on the fermentation titer of vancomycin

2.1.2 氮源濃度的確定(豆粕、大豆粉) 試驗(yàn)方法同上，確定最優(yōu)的豆粕濃度、大豆粉濃度。試驗(yàn)結(jié)果如圖3、圖4所示。氮源可調(diào)節(jié)微生物的生長速度及菌體量［4］。由上圖3、4可見，豆粕濃度為2.2%、大豆粉濃度為2.2%時，萬古霉素的發(fā)酵效價最高。當(dāng)豆粕和大豆粉濃度大于2.2%時，發(fā)酵效價水平下降迅速，而小于2.2%時對發(fā)酵水平影響較小，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中配置培養(yǎng)基時，要嚴(yán)格控制兩者的濃度水平不大于2.2%。確定最優(yōu)的氮源濃度豆粕為2.2%、大豆粉為2.2%。

圖3 豆粕濃度對萬古霉素發(fā)酵效價的影響Fig.3 Effect of the soybean meal concentration on the fermentation titer of vancomycin

圖4 大豆粉濃度對萬古霉素發(fā)酵效價的影響Fig.4 Effect of the soybean flour concentration on the fermentation titer of vancomycin

2.1.3 無機(jī)鹽濃度的確定(氯化鈉、碳酸鈣)試驗(yàn)方法同上，確定最優(yōu)的氯化鈉、碳酸鈣濃度。試驗(yàn)結(jié)果如圖5、圖6所示。無機(jī)鹽離子影響微生物的生理活性［5］。由上圖5、6可見，氯化鈉濃度為0.2%、碳酸鈣濃度為0.2%時，萬古霉素的發(fā)酵效價最高。其中氯化鈉濃度對發(fā)酵效價影響不大，而碳酸鈣濃度低于0.2%時，對發(fā)酵水平影響很大，在培養(yǎng)基配制中要注意控制。確定最優(yōu)的無機(jī)鹽濃度氯化鈉為0.2%、碳酸鈣為0.2%。

2.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗(yàn) 發(fā)酵培養(yǎng)基中影響發(fā)酵水平最重要的是碳源和氮源。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取碳源葡萄糖、淀粉，氮源豆粕、大豆粉，設(shè)計4因素3水平正交表，進(jìn)行菌種發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)［6-7］，因素水平表見表1。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

圖5 氯化鈉濃度對萬古霉素發(fā)酵效價的影響Fig.5 Effect of the sodium chloride concentration on the fermentation titer of vancomycin

圖6 碳酸鈣濃度對萬古霉素發(fā)酵效價的影響Fig.6 Effect of the calcium carbonate concentration on the fermentation titer of vancomycin

從表2中極差項(xiàng)可以看出，以上4個因素對萬古霉素發(fā)酵水平影響的強(qiáng)度依次為葡萄糖＞大豆粉＞豆粕＞淀粉，其中最佳試驗(yàn)結(jié)果為第6組，即最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖2.0%，淀粉3.0%，豆粕1.8%，大豆粉2.2%，氯化鈉0.2%，碳酸鈣0.2%。將此配方培養(yǎng)基進(jìn)行多次平行實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)量較穩(wěn)定，與原培養(yǎng)基比較，發(fā)酵效價水平提高11.2%。

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 二級種接種量對發(fā)酵效價的影響 接種量與菌種的生長繁殖速度有關(guān)［8］。根據(jù)單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，其他條件不變，分別將不同體積的二級種培養(yǎng)液(2%、5%、10%、15%)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，考察接種量對發(fā)酵效價的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table1 Design table of factors and levels of the orthogonal experiment

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 The result of L9(34)the orthogonal experiment

由圖7可見，接種量為10%，萬古霉素的發(fā)酵效價最高。隨著接種量的增加，萬古霉素發(fā)酵效價逐步升高，當(dāng)接種量超過10%時，發(fā)酵水平開始下降。因此確定發(fā)酵的二級種接種量為10%。

2.2.2 裝液量(溶氧)對發(fā)酵效價的影響 溶氧是萬古霉素發(fā)酵控制的一個關(guān)鍵因素［9］。在搖床轉(zhuǎn)速一定的情況下，以不同的發(fā)酵搖瓶裝液量來表示菌株對溶氧的需求。其他條件不變，搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min，在250 mL三角瓶中分別裝入不同體積(15、25、50、75 mL)的發(fā)酵培養(yǎng)基，考察裝液量對發(fā)酵效價的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。

圖7 二級種接種量對萬古霉素發(fā)酵效價的影響Fig.7 Effect of the inoculum of the second level’s seed liquid on the fermentation titer of vancomycin

圖8 裝液量對萬古霉素發(fā)酵效價的影響Fig.8 Effect of the filling volume on the fermentation titer of vancomycin

由圖8可見，250 mL三角瓶裝液量為25 mL時，萬古霉素的發(fā)酵水平最高。裝液量大于25 mL時，發(fā)酵效價迅速降低。因此確定250 mL三角瓶最優(yōu)的裝液量為25 mL。

2.3 50 L發(fā)酵罐驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件，接入50 L發(fā)酵罐進(jìn)行驗(yàn)證，連續(xù)進(jìn)罐5批。以第1批進(jìn)罐效價作為對照，其他批次效價與之比較作為相對效價，結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，優(yōu)化后的萬古霉素發(fā)酵工藝，在較大的發(fā)酵罐中保持了良好的適應(yīng)性和連續(xù)性，適合進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。

表3 50 L發(fā)酵罐驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table3 The result of the verification experiment for 50 L-fermentation tank

3 討論

通過對萬古霉素發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化研究，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組合為葡萄糖2.0%，淀粉3.0%，豆粕1.8%，大豆粉2.2%，碳酸鈣0.2%，氯化鈉0.2%。優(yōu)化后的發(fā)酵條件為二級種接種量為10%，裝液量為250 mL搖瓶中25 mL。根據(jù)優(yōu)化后的發(fā)酵工藝進(jìn)行50 L罐驗(yàn)證，表明該工藝條件生產(chǎn)效價水平具備良好的連貫性和適應(yīng)性，適合進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。

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