桓明輝，關艷麗，陳 飛

(遼寧省微生物科學研究院，遼寧朝陽 122000)

DH5α是一種常用于質粒克隆的菌株。E.coli DH5α在使用pUC系列質粒載體轉化時，可與載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端實現(xiàn)α-互補，可用于藍白斑篩選鑒別重組菌株。感受態(tài)細胞的制備和轉化是分子生物學實驗室頻繁使用的一項重要的常規(guī)操作。對細菌而言，為達到高效轉化，活細胞數(shù)務必少于108細胞/mL。對于大多數(shù)E.coli來說，相當于 OD600為 0.4 左右，但由于轉化是一個很復雜的過程，具體的作用機理仍在探究中。有文獻指出［1］，細菌的最佳感受態(tài)細胞制備期對于不同菌株是不同的，并不一定都是在活細胞濃度為108細胞/mL的時候最適宜，有必要針對所使用的菌株確定其最佳轉化條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 E.coli DH5α，pUC18質粒由本實驗室保存。

1.1.2 試劑 X-gal，IPTG，LB培養(yǎng)基，氨芐青霉素溶液，0.1 mol/L CaCl2溶液，均按《分子克隆實驗指南》的要求配制。

1.2 方法

1.2.1 大腸埃希菌生長情況的測定［2-3］從平板上挑取單個菌落(直徑2～3 mm)到含有30 mL LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃下250 r/min培養(yǎng)過夜。取出0.3 mL培養(yǎng)物到含有15 mL LB培養(yǎng)基試管中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔20 min取出1支試管，放于冰箱。統(tǒng)一測定菌液的OD600，繪制生長曲線。選取幾個不同時相的菌液倍比稀釋從10－1～10－6，各取0.1 mL稀釋液涂布 LB 平板培養(yǎng)基，37℃正向培養(yǎng)1 h后，倒置培養(yǎng)12～16 h。每個稀釋度鋪3個平板，計數(shù)，作OD600-活菌細胞濃度圖。

1.2.2 標準質粒制備［4］利用裂解法抽提pUC18質粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外分析儀下觀察，將顯示為超螺旋DNA帶型的凝膠切下，利用透析袋法進行回收后，電泳確保質粒全部為超螺旋狀態(tài)，測定其濃度及純度，IE緩沖液稀釋為0.05 μg/mL，保存于 －20 ℃。

1.2.3 大腸埃希菌感受態(tài)細胞制備及轉化［5-7］37℃下250 r/min培養(yǎng)過夜的大腸埃希菌培養(yǎng)物，按1∶40接種于15 mL LB培養(yǎng)基的試管中，繼續(xù)振蕩擴大培養(yǎng)。根據(jù)生長曲線，每隔一定時間取1支菌液，測定OD600后，1.5 mL轉入10 mL無菌離心管，冰浴中冷卻10 min，4℃，4 000 r/min離心10 min，棄上清，用1/2體積的預冷0.1 mol/L CaCl2溶液懸浮細胞，冰浴中放置30 min，4℃，4 000 r/min離心10 min。根據(jù)OD600-活菌細胞濃度圖，加入一定體積的0.1 mol/L CaCl2溶液，調整細胞濃度為2.5×109細胞/mL，取200 μL感受態(tài)細胞，分裝到1.5 mL無菌離心管，4℃保存過夜。加入0.1 g質粒DNA，冰浴30 min后42℃熱休克60～90 s，冰浴中迅速冷卻2～3 min，加入0.8 mL LB培養(yǎng)基，37℃低速振蕩培養(yǎng)1 h，室溫，4 000 r/min 離心5 min，吸去0.9 mL 培養(yǎng)基，混勻剩余培養(yǎng)物，全部涂布在加有X-gal，IPTG及氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上，37℃正向培養(yǎng)1 h后，倒置培養(yǎng)12～16 h，每個時相涂布9個平板，并以未加質粒DNA的轉化液作對照。

2 結果與分析

2.1 E.coil DH5α的生長曲線

在菌株與菌株之間，OD值與每毫升中活細胞數(shù)間的關系變化很大，因此有必要通過測定特定E.coli的生長培養(yǎng)物在生長周期的不同時相的OD600，從0～10 h，測定細菌不同生長時期的OD600，繪制生長曲線。為保證細菌培養(yǎng)物的生長密度不至過高，應每隔15～20 min檢測OD600(表1)。得到E.coli DH5α的生長曲線(見圖1)，以便預測培養(yǎng)物的OD600達到0.4的培養(yǎng)時間。如圖1所示，該生長曲線主要包括了E.coli DH5α在37℃培養(yǎng)條件下群體生長周期中的遲緩期、對數(shù)期及穩(wěn)定期初期。

2.2 E.coli DH5α的 OD600-活菌細胞濃度圖

將10－4、10－5、10－6稀釋度的培養(yǎng)物涂布于無抗生素的LB平板培養(yǎng)基上以計算每一時相的活細胞數(shù)，選取一組數(shù)據(jù)(見表2)經(jīng)線性化處理得E.coli DH5α 的 OD600-活菌細胞濃度圖(圖2)，使分光光度計讀數(shù)得到標準化。由圖2可看出細菌細胞濃度與菌液光密度值成正比。

表1 E.coli DH5α的生長曲線Table 1 Growth curve of E.coli DH5α

圖1 E.coli DH5α的生長曲線Fig.1 Growth curve of E.coli DH5α

表2 E.coil DH5α的OD600-活菌細胞濃度Table 2 E.coil DH5α 的OD600-Viable cell concentration

2.3 不同生長時期的E.coli DH5α菌株轉化率的測定

細菌在不同生長時期的活細胞濃度不同。要進行不同生長時期轉化率的比較，必須調整細胞密度至相同情況。為達到高效轉化，活細胞數(shù)務必少于 108細胞/mL。根據(jù) CaC12法，第 2次CaCl2處理時，活細胞濃度濃縮至2.5×109細胞/mL，轉化菌平板培養(yǎng)后計數(shù)，并計算轉化率(每微克DNA轉化后所產(chǎn)生的單菌落個數(shù)，菌落數(shù)/μg DNA)，見表3。結果如圖3所示，發(fā)現(xiàn)感受態(tài)細胞的轉化率與OD600值顯著相關。E.coli DH5α菌株在OD600值為0.40～0.42時獲得最高轉化率。

圖2 E.coli DH5α的OD600值-活菌細胞濃度圖Fig.2 E.coli DH5α OD600-Viable cell concentration diagram

圖3 E.coil DH5α不同生長時期的轉化率Fig.3 Transformation of E.coil DH5α in the different fevelopment

表3 E.coil DH5α不同生長時期的轉化率Table 1 Transformation of E.coil DH5α in the different fevelopment

3 討論

細菌轉化率取決于細菌被質粒轉化的能力以及細菌的數(shù)量，隨著細菌生長，單位體積內的細菌數(shù)目增加，細菌被質粒轉化的能力有所下降，尤其當生長過度后下降更為明顯［8］。因此，合適的生長濃度應該能保證上述兩方面的綜合效應處于理想范圍。

大腸埃希菌群體生長周期包括遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期。結合所繪制的生長曲線可知:當 OD600值為 0.40 ～0.42 時，細菌正處在對數(shù)期的中期，此時，細菌處于最理想的生長狀態(tài)。細菌在該期生命力強，對轉化緩沖液的反應性強，被誘導處于感受態(tài)的細菌較多［9］，本研究獲得轉化率為2×106～4×106cfu/μg DNA的感受態(tài)細胞，可完全滿足常規(guī)分子克隆操作對感受態(tài)細胞的要求。同時研究還應注意到，當加入的外源DNA的量過多或體積過大時，則會使轉化率下降，所以DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5%。

［1］ J薩姆布魯克，DW拉塞爾，黃培堂譯.分子克隆實驗指南(第3版)［M］.北京:科學出版社，2002:87-96.

［2］ 糾敏，汪倫記，張敏.大腸埃希菌感受態(tài)細胞轉化能力影響因素的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)學報，2007，13(16):23-24.

［3］ 盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學實驗技術［M］.北京:高等教育出版社，1995.

［4］ 李代宗，趙曉瑜，倪志華，等.少量制備大腸埃希菌感受態(tài)細胞條件探索［J］.生物技術，2006，16(6):55-57.

［5］ 倪志華，趙曉瑜，劉建榮，等.堿裂解提取質粒DNA的改進方法［J］.河北大學學報(自然科學版)，2005，25(2):222-224.

［6］ 朱帆，劉忠純，李健.大腸埃希菌質粒的快速提?。跩］.微生物學雜志，2004，24(3):59.

［7］ 蔣雋，劉小蘭，馬海明，等.豬腸毒素大腸埃希菌F4受體的微衛(wèi)星標記篩選［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2010，36(3):321-325.

［8］ 陳飛，吳紅艷，桓明輝，等.Tetramycin抗性基因克隆及生物活性的測定［J］.微生物學雜志，2012，32(1):17-22.

［9］ 劉平，李宗軍，許愛清.茯磚茶水提物對大腸埃希菌感染小鼠的免疫調節(jié)作用［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2011，37(5):537-539.