吳亞寧，劉剛，余少文，李水明，王娟，*

（1.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518060；2.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518060）

嗜熱真菌是一類最低生長(zhǎng)溫度為20 ℃或20 ℃以上，最高生長(zhǎng)溫度為50 ℃或50 ℃以上的特殊真菌類群[1-2]。因其極端的生長(zhǎng)環(huán)境，其內(nèi)部蘊(yùn)含大量的耐高溫降解酶系，是耐高溫酶的主要來源。因此，從分離的嗜熱真菌中鑒定耐高溫的木質(zhì)纖維素降解酶、克隆相關(guān)基因，在可再生生物資源的有效利用方面具有重要社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。

隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，質(zhì)譜分析為蛋白質(zhì)的鑒定提供了重要的技術(shù)保障，使蛋白質(zhì)的鑒定更加快速化、準(zhǔn)確化和靈敏化，從而可以在蛋白質(zhì)水平上得到更多的基因表達(dá)信息，這對(duì)促進(jìn)生命科學(xué)的發(fā)展具有重要的意義。而蛋白酶做為蛋白質(zhì)家族的重要成員，其對(duì)生命活動(dòng)的調(diào)控發(fā)揮著巨大作用，所以利用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)蛋白酶的快速鑒定，無疑可加快人們對(duì)蛋白酶的開發(fā)利用。目前，質(zhì)譜分析技術(shù)在酶鑒定中的應(yīng)用已越來越廣泛。如孫明忠等利用激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)白眉蝮蛇蛇毒酶進(jìn)行了研究[3]；呂磊等利用生物質(zhì)譜對(duì)耐藥相關(guān)果糖二磷酸醛縮酶C 進(jìn)行了分析與鑒定[4]；黃河清等利用基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜法對(duì)海兔卵多肽內(nèi)切酶的組成、結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了研究[5]；Peterson 等使用質(zhì)譜分析法鑒定了真菌的甘露聚糖酶[6]。

木聚糖酶是一類可以將木聚糖降解成低聚木糖或木糖的復(fù)合酶系，廣泛應(yīng)用于造紙、食品、飼料等行業(yè)。本文利用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)嗜熱踝節(jié)菌中誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)酶譜差異條帶進(jìn)行分析，成功鑒定到一個(gè)糖苷第11 家族的內(nèi)切木聚糖酶TtXynA，并通過TAIL-PCR 擴(kuò)增獲得其全長(zhǎng)序列，該基因是從嗜熱踝節(jié)菌中克隆到的第一個(gè)木聚糖酶基因。

1 材料與方法

1.1 菌株的培養(yǎng)

1.1.1 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L～20 g/L。

液體種子培養(yǎng)基：Mandels 營(yíng)養(yǎng)鹽濃縮液100 mL/L，Mandels 微量元素濃縮1.0 mL/L，葡萄糖10 g/L，蛋白胨1 g/L，1 mol/L 的檸檬酸緩沖液（pH4.5）50 mL/L，吐溫80 1.5 mL/L。

木聚糖酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基：玉米芯粉30 g/L，Mandels 營(yíng)養(yǎng)鹽濃縮液200mL/L，Mandels 微量元素濃縮液1.0mL/L，葡萄糖3 g/L，蛋白胨1 g/L，1 mol/L 的檸檬酸緩沖液（pH4.5）50 mL/L，吐溫80 1.5 mL/L。

非誘導(dǎo)培養(yǎng)基：Mandels 營(yíng)養(yǎng)鹽濃縮液200 mL/L，Mandels 微量元素濃縮液1.0 mL/L，葡萄糖3 g/L，蛋白胨1 g/L，1 mol/L 的檸檬酸緩沖液（pH4.5）50 mL/L，吐溫80 1.5 mL/L。

1.1.2 誘導(dǎo)及非誘導(dǎo)培養(yǎng)

將純化菌株在PDA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d 左右，然后用無菌水洗孢子，取3 mL 接種于含有30 mL 液體種子培養(yǎng)基的三角搖瓶中，于50 ℃，250 r/min 條件下震蕩培養(yǎng)3 d～4 d 后，各取3 mL 液體種子分別接種到含有30 mL 木聚糖酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基及非誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角搖瓶中，于50 ℃，250 r/min 條件下震蕩培養(yǎng)4 d 后，分別取其發(fā)酵液于12 000 r/min 離心5 min，取上清液進(jìn)行木聚糖酶酶活測(cè)定[7]。

1.2 木聚糖酶酶活測(cè)定

木聚糖酶酶活測(cè)定參照Bailey 等的方法[8]進(jìn)行。木聚糖酶活力的測(cè)定方法是根據(jù)木聚糖酶可將木聚糖水解成木糖的原理?；盍挝徊捎脟H單位，定義為在水解反應(yīng)中每分鐘形成1 μmol 的還原糖量（以木糖計(jì)）所需要的酶量為一個(gè)活力單位（IU）。具體步驟如下：在25 mL 刻度反應(yīng)管中加入1.8 mL 2%的木聚糖（使用0.05 mol/L，pH5.5 的檸檬酸鈉緩沖液配制），50 ℃預(yù)熱5 min，然后加入0.2 mL 適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液上清，于復(fù)式恒溫水?。?0 ℃）中振蕩5 min；取出反應(yīng)管，迅速加入3 mL DNS 試劑，沸水浴15 min；流水冷卻后，在540 nm 下測(cè)定吸光值；根據(jù)木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酶反應(yīng)過程所釋放的木糖量?？瞻讓?duì)照組：在25mL 刻度反應(yīng)管中加入1.8 mL 2 %的木聚糖，50 ℃預(yù)熱5 min，加入3 mL DNS 試劑，加入0.2 mL 適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液上清迅速沸水浴15 min，流水冷卻后，在540 nm下調(diào)零。

1.3 非變性膠的配制及電泳

非變性膠5×Loading Buffer（不含SDS 及β—疏基乙醇）為250 mmol/LTris-HCl（pH 6.8）、0.5%（g/mL）溴酚蘭和50%（體積比）甘油。非變性膠電泳緩沖液為不含SDS 的1×Tris-Glycine Buffer（0.025 mol/L Tris，0.25 mol/L Glycine）。

配12%的非變性膠（不加SDS，其它組份不變），在膠板上將最左側(cè)的泳道標(biāo)為1，與1 相鄰的泳道標(biāo)記為2，其余泳道不標(biāo)記。[將誘導(dǎo)及非誘導(dǎo)的上清與非變性膠5×Loading Buffer 進(jìn)行1 ∶4（體積比）的混合]（不加熱）后上樣，第1 泳道加樣孔上非誘導(dǎo)的上清，第2 及其余泳道均為誘導(dǎo)上清，進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳過程在冰上進(jìn)行，保持低溫，以免蛋白變性。電泳結(jié)束后，將第1 和第2 泳道連在一起切下進(jìn)行快速考染（用微波爐加熱煮沸2 次～3 次后，染色10 min～20 min）和快速脫色（脫色10 min～20 min），剩余膠塊用保鮮膜包好后置于4 ℃冰箱內(nèi)保存。

快速脫色后，將其與原來未染色的膠塊放在一起，拼成一塊完整的膠。以第1 泳道為對(duì)照，在未染色的膠塊中將第2 泳道和第1 泳道顯著不同的條帶對(duì)應(yīng)的膠塊切下，置于1.5 mL 的EP 管中并加入適量的檸檬酸鈉緩沖液（pH5.5），用小研棒將膠塊細(xì)細(xì)研磨。離心取上清，測(cè)木聚糖酶酶活。

1.4 SDS-PAGE

配制15%的變性膠，在膠板上取3 個(gè)相鄰的泳道分別標(biāo)記為1、2、3，第1 泳道為非誘導(dǎo)上清，第2 泳道為誘導(dǎo)上清，第3 泳道為切膠回收后有酶活的上清。上樣后，進(jìn)行SDS-PAGE，常規(guī)染色及脫色。

1.5 切膠

將200 μL 槍頭在約1cm 處剪斷，在剪斷的槍頭內(nèi)吸少量超純水（易于將切下的蛋白膠粒打出），將所需蛋白質(zhì)點(diǎn)用已剪斷的槍頭切下，并放入裝有100 μL超純水的小PCR 管中。在溫控板上25 ℃振蕩并進(jìn)行水洗、平衡、脫色、平衡。

1.6 質(zhì)譜分析

參照Li 等[9]已報(bào)道的膠內(nèi)酶切法進(jìn)行預(yù)處理，利用質(zhì)譜儀（Bruker Daltonios）對(duì)得到的肽段進(jìn)行MALDI-TOF 質(zhì)譜鑒定。得到蛋白樣品的肽質(zhì)量指紋圖，通過本地化的MASCOT 軟件（Version 2.2，Matrix Science）在數(shù)據(jù)庫[NCBInr 20120922]中進(jìn)行蛋白質(zhì)檢索。設(shè)定參數(shù)為：Max Missed Cleavages：1；Fixed Modifications；Carboxymethyl（C）；Variable Modifications：Oxidation（M）；Mass values：MH+、Monoisotopic；Peptide Mass Tolerance：±0.2Da。若鑒定結(jié)果得分大于83分（P＜0.05），說明搜庫結(jié)果可信。

1.7 同源片段的克隆

根據(jù)質(zhì)譜分析的肽段序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物PF：5'-TGGAAYCCNGGNYTNAAYGC -3'；PR：5' -GCCCAN GCRTCRAARTGRCANCC-3'，以嗜熱踝節(jié)菌基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。將目的片段切膠回收，連接pMD18-T 載體測(cè)序，得出中間序列。

1.8 TAIL-PCR 克隆全長(zhǎng)基因

利用TAIL-PCR 方法[10]分別擴(kuò)增TtXynA 基因的5'末端和3'末端，TAIL-PCR 擴(kuò)增過程中用到的特異性引物（Specific primer）見表1，隨機(jī)引物（Arbitrary degenerate primer，AD）參考劉自勇等的文獻(xiàn)[11]。TAIL-PCR 的反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)設(shè)置參考Takara 公司的Genome Walking Kit 說明書，即3 條特異性引物分別與7 條隨機(jī)引物進(jìn)行三輪反應(yīng)后，將第三輪的目的片段切膠回收，連接pMD-19-T 載體測(cè)序。根據(jù)獲得的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)引物TtxynF 及TtxynR（表1）擴(kuò)增TtXynA 基因全長(zhǎng)。

表1 Tail-PCR 特異性引物Table 1 The specific primers of Tail-PCR

1.9 TtXynA 同源蛋白的進(jìn)化分析

根據(jù)Kimura 雙參數(shù)模型用臨近相鄰法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建TtXynA 及其同源蛋白的進(jìn)化樹[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶譜分析

用非變性膠對(duì)粗酶液進(jìn)行第一次分離純化，根據(jù)對(duì)非變性膠中酶譜的分析，可以進(jìn)行切膠回收，測(cè)酶活，如果有酶活，再將有酶活的酶液進(jìn)行第二次分離純化即進(jìn)行SDS-PAGE，再根據(jù)對(duì)變性膠中酶譜的分析，可以確定出目的蛋白條帶。誘導(dǎo)及非誘導(dǎo)的酶譜見圖1。

圖1 嗜熱踝節(jié)菌產(chǎn)木聚糖酶誘導(dǎo)及非誘導(dǎo)的酶譜Fig.1 The zymogram of Talaromyces thermophilus with induced and non-induced culture

2.2 質(zhì)譜分析結(jié)果

MASCOT 軟件在數(shù)據(jù)庫[NCBInr 20120922]中進(jìn)行蛋白質(zhì)檢索的結(jié)果表明，該蛋白與擬青霉屬Paecilomyces sp.J18 的內(nèi)切木聚糖酶（GeneBank 編號(hào)：ACS26244.1）高度同源，鑒定結(jié)果得分為188 分，表明搜庫結(jié)果可信。另外，還與長(zhǎng)枝木霉Thermomyces lanuginosus 的內(nèi)切木聚糖酶（gi|335371365）具有一定同源性，鑒定結(jié)果得分為83 分。

2.3 基因全長(zhǎng)的獲得

根據(jù)質(zhì)譜分析獲得的肽段序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得嗜熱踝節(jié)菌木聚糖酶基因的中間序列，利用TAIL-PCR 技術(shù)擴(kuò)增該基因的5'和3'端序列。經(jīng)過各三輪TAIL-PCR 擴(kuò)增，得到一個(gè)900 bp 左右的5'端片段和一個(gè)500 bp 左右的3'端片段。將兩個(gè)片段進(jìn)行測(cè)序，并與擬青霉木聚糖酶基因進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，最后，將測(cè)序結(jié)果與已擴(kuò)增的中間同源片段拼接，得出基因全長(zhǎng)序列為788 bp，根據(jù)設(shè)計(jì)的上下游引物TtxynF、TtxynR，成功擴(kuò)增出TtXynA 基因全長(zhǎng)序列見圖2，其DNA 序列已提交至NCBI，登錄號(hào)為KC422245。該基因含有一個(gè)內(nèi)含子，無CBM 結(jié)構(gòu)域。對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)屬于糖苷水解酶第11 家族的成員。

圖2 TtXynA 基因全長(zhǎng)Fig.2 Full-length of TtXynA

2.4 TtXynA 及其同源蛋白的進(jìn)化分析

將嗜熱踝節(jié)菌TtXynA 蛋白序列與GenBank 中數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，從中得到多種不同來源的木聚糖酶基因，與TtXynA 蛋白具有較高的序列同源性。其種類（登錄號(hào)）分別為：Paecilomyces sp.J18（ACS26244）、Thermomyces lanuginosus（AEH57194）、Trichoderma reesei（AAB29346）、Aspergillus fumigates（ADM47839）、Humicola grisea var.thermoidea（AAG16891）、Myceliophthora thermophila ATCC 42464（XP_003664784）、Chaetomium thermophilum var.thermophilum DSM 1495（EGS20234）。利用CLUSTAL X 軟件將這8 個(gè)蛋白序列匹配排列后，再利用MEGA 5.0 軟件采用NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3，通過進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)與嗜熱踝節(jié)菌TtXynA 蛋白序列同源性較高的是擬青霉（Paecilomyces sp.J18）木聚糖酶，與來自疏棉狀嗜熱絲孢菌、里氏木霉、煙曲霉的木聚糖酶親緣關(guān)系較近，與來自灰腐質(zhì)霉高溫變種、嗜熱毀絲霉和嗜熱毛殼霉變種的木聚糖酶關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖3 根據(jù)Kimura 雙參數(shù)模型用NJ 法構(gòu)建TtXynA 及其同源蛋白的進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic trees based on homologous TtXynA sequences using NJ method by Kimura’s two-parameter model

3 討論

我們通過前期實(shí)驗(yàn)分離鑒定了具有木聚糖酶活性的嗜熱踝節(jié)菌WYN9，該菌屬于藍(lán)狀菌屬真菌，但該菌種基因組序列未知，基因庫中相關(guān)序列極少。我們?cè)占{(lán)狀菌屬及與其親緣關(guān)系較近種屬來源的11家族木聚糖酶序列信息，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增對(duì)應(yīng)木聚糖酶基因序列，但未獲得任何有意義的基因片段。通過對(duì)嗜熱踝節(jié)菌產(chǎn)木聚糖酶誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)酶譜的分析，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后出現(xiàn)的條帶清晰，對(duì)應(yīng)蛋白大小與11 家族木聚糖酶大小吻合，約23 kDa 左右。結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)成功鑒定到一個(gè)糖苷第11 家族的內(nèi)切木聚糖酶TtXynA，并通過TAIL-PCR 擴(kuò)增獲得TtXynA 基因全長(zhǎng)序列。本研究的結(jié)果表明通過質(zhì)譜-酶譜方法聯(lián)合分析未知蛋白是一種快速高效的鑒定蛋白質(zhì)的方法。

TtXynA 基因是從嗜熱踝節(jié)菌中克隆到的第一個(gè)木聚糖酶基因，但對(duì)應(yīng)蛋白序列與擬青霉木聚糖酶100%同源，與疏棉狀嗜熱絲孢菌Thermomyces lanuginosus 木聚糖酶（AEH57194.1）同源性為82%，以及結(jié)合TtXynA 同源基因的進(jìn)化分析，結(jié)果表明在真菌中半纖維素降解酶超蛋白家族的成員廣泛存在，并在降解過程中發(fā)揮重要作用。在蛋白酶的長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，推測(cè)該蛋白因具有較強(qiáng)的木聚糖降解能力而在不同種屬的菌株中被完整的保存下來。目前，在真菌中發(fā)現(xiàn)的11 家族木聚糖酶已有多種，主要分布在木霉[14]、曲霉屬[15]、青霉屬[16]、鏈格孢屬[17]等絲狀真菌中。然而，其中具備嗜熱特性的木聚糖酶并不多，我們對(duì)嗜熱踝節(jié)菌WYN9 胞外木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究的結(jié)果表明，其胞外粗酶液于60 ℃保存30 min 后，酶活可保持原始酶活的95%以上（未發(fā)表），因此，可初步判斷TtXynA 具有耐熱的特點(diǎn)。有熱穩(wěn)定特性的木聚糖酶具有更廣泛的應(yīng)用，在后續(xù)研究中，我們將對(duì)該基因進(jìn)行異源表達(dá)、純化，進(jìn)一步確認(rèn)該蛋白的酶學(xué)性質(zhì)、催化活性及底物降解特異性等，并在相關(guān)的領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。

[1]Cooney D G,Emerson R.Thermophilic Fungi：An account of their biology,activities and classification[M].WHFreeman&Co,San Francisco,1964：27-42

[2]Mouchacca J.Thermophilic Fungi：Biodiversity and Taxonomic Status[J].Cryptogamie mycology,1997：18(1)：19-69

[3]孫明忠,劉志強(qiáng),丁蘭,等.白眉蝮蛇蛇毒及蛇毒酶的激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜研究[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào),2000,21(4)：538-540

[4]呂磊,劉志強(qiáng),李麗,等.耐藥相關(guān)果糖二磷酸醛縮酶C 的生物質(zhì)譜分析與鑒定[J].化學(xué)學(xué)報(bào),2006,64(16)：1700-1704

[5]黃河清,陸永進(jìn),林慶梅,等.基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜法研究海兔卵多肽內(nèi)切酶組成、結(jié)構(gòu)與功能[J].分析化學(xué)研究報(bào)告,2007,35(8)：1105-1110

[6]Peterson R,Grinyer J,Joss J,et al.Fungal proteins with mannanase activity identified directly from a Congo Red stained zymogram by mass spectrometry[J].Journal of microbiological methods,2009,79(3)：374-377

[7]麥國琴,許曉萍,余翠媚,等.產(chǎn)木聚糖酶和纖維素酶真菌的酶學(xué)性質(zhì)分析[J].食品研究與開發(fā),2011,32(9)：179-182

[8]Bailey M J,Biely P,Poutanen K.Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity[J].Journal of biotechnology,1992(23)：257-270

[9]Li J K,Feng M,Zhang L,et al.Proteomics analysis of major royal jelly protein changes under different storage conditions[J].Journal of proteome research,2008,7(8)：3339-3353

[10]Liu Y,Whittier R F.Thermal asymmetric interlaced PCR：automatable amplification and sequencing of insert end fragment from P1 and YAC clones for chromosome walking[J].Genomics,1995,25(3)：674-681

[11]劉自勇,孫憲昀,曲音波.斜臥青霉114-2 cbh1 基因的TAIL-PCR克隆及與抗阻遏突變株JU-A10 的比較[J].微生物學(xué)報(bào),2008,48(5)：667-671

[12]李焰焰,聶傳朋,曹家樹.十字花科蔬菜BcMF13 同源基因的克隆及進(jìn)化分析[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2011,17(2)：207-210

[13]Roy A,Kucukura A,Zhang Y.I-TASSER：a unified platform for automated protein structure and function prediction[J].Nature protocols,2010,5(4)：725-738

[14]Li J,Wang J,Wang S,et al.Achieving efficient protein expression in Trichoderma reesei by using strong constitutive promoters[J].Microb Cell Fact,2012,11(6)：84-93

[15]Zhang H,Wu M,Li J,et al.Cloning and expression of a novel xylanase gene(Auxyn11D)from Aspergillus usamii E001 in Pichia pastoris[J].Applied biochemistry and biotechnology,2012,167(8)：2198-2211

[16]Wang J,Mai GQ,Liu G,et al.Molecular cloning and heterologous expression of an acid-stable endoxylanase gene from Penicillium oxalicum in Trichoderma reesei[J].J Microbiol Biotechnol,2013,23(2)：251-259

[17]Liangwei Mao,Po Meng,Cheng Zhou,et al.Molecular cloning and heterologous expression of an acid stable xylanase gene from Alternaria sp.HB186[J].World J Microbiol Biotechnol,2012,28(3)：777-784