陳寶，張立穎，沈芳，*，樊紅日，劉雄民，馮龍

（1.廣西大學化學化工學院，廣西南寧 530004；2.廣西工業(yè)職業(yè)技術學院食品與生物工程系，廣西南寧 530001）

迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）屬唇形科迷迭香屬植物[1]，原產地中海沿岸一帶，目前我國很多地區(qū)都有種植。迷迭香中含有萜類、黃酮、有機酸、多支鏈烷烴及氨基酸等多種化學成分。其中，黃酮類成分的研究較早，迄今為止已從迷迭香中分離出30 余種黃酮類化合物，主要包括橙皮素、芹菜素、薊黃素、白楊素、高車前苷、6-羥基木犀草素-7-葡萄糖苷等，具有抗菌、消炎、降壓、抗氧化、抗癌等作用[2-3]。迷迭香總黃酮的研究僅見吳建章等[4]對迷迭香黃酮的甲醇索氏提取，且黃酮提取率較低。本試驗以廣西巴馬迷迭香為原料，采用乙醇熱浸提法[5-6]提取黃酮類化合物，并優(yōu)化提取工藝，旨在提高總黃酮的提取率，為該資源的開發(fā)利用提供科學的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

廣西巴馬迷迭香；蘆丁標準品，中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、石油醚（沸程60 ℃～90 ℃）、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉等均為國產分析純（AR）。

1.2 儀器

UV-2550 型紫外可見分光光度計：日本島津公司；DF-101B 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市英峪予華儀器廠；FZ102 型微型植物粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；AR224CN 電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 迷迭香總黃酮的提取

提取工藝流程：干燥的迷迭香→粉碎過60 目篩→石油醚回流脫脂、脫色→風干→精確稱取定量脫脂干粉→乙醇回流浸提→冷卻、抽濾→總黃酮提取液→定容至料液比相應體積得供試品溶液。

1.3.2 標準曲線的制作[7]

精確稱取在120 ℃干燥至恒重的蘆丁標準品5.0 mg，置于50 mL 棕色容量瓶中，用60 %的乙醇溶解并定容至刻度線，配得0.1 mg/mL 的蘆丁標準溶液。精確量取該蘆丁液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，分別加入5 %的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；再分別加入10 %的A（lNO）33溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；最后分別加入4 %的NaOH 溶液4.0 mL，用60 %的乙醇溶液定容至刻度線，搖勻，靜置15 min。以相應試劑為空白，于505 nm波長處測定樣液吸光度，并繪制蘆丁標準溶液濃度C（mg/mL）與吸光度A 的標準曲線。

1.3.3 總黃酮含量的測定

精密吸取40 μL 供試品溶液置于10 mL 容量瓶中，按照“1.3.2”中方法測定吸光度，根據標準曲線回歸方程計算供試品中總黃酮的含量，并用下面的公式計算總黃酮的提取率：

1.3.4 精密度試驗

精密吸取蘆丁對照品溶液適量，按“1.3.2”方法重復測定6 次，RSD ＝0.31%。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗

對同一份供試品溶液，每隔5 min 按“1.3.2”方法測定1 次含量，共測6 次，RSD＝1.12%，表明迷迭香提取液在30 min 內穩(wěn)定。

1.3.6 加標回收試驗

精密吸取已知含量的樣品6 份，分別加入不同體積的蘆丁對照品溶液，按“1.3.2”方法測定，平均回收率為99.81%，RSD＝2.78%。

2 結果與討論

2.1 標準曲線

標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

蘆丁標準溶液在濃度0.002 mg/mL～0.016 mg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系，其回歸方程y=9.685 7x-0.006 4，相關系數(shù)R2=0.999 1，x 為蘆丁標準溶液濃度（mg/mL），y 為吸光度A。

2.2 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

精確稱取2.000 g 迷迭香干粉5 份，按料液比1 ∶20（g/mL）分別加入濃度為40%、50%、60%、70%和80%的乙醇各40 mL，70 ℃回流提取3 h，結果見圖2。

圖2 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on yield of total flavonoids

由圖2 可知，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮提取率先增大而后減小。當乙醇濃度為50%時，總黃酮提取率最大。當乙醇濃度繼續(xù)增加時，總黃酮提取率依次減小，這可能是由于一些脂溶性雜質、親脂性強的成分溶出增多，導致黃酮類化合物的浸出減少。故選擇50%乙醇為迷迭香總黃酮最佳提取濃度。

2.3 料液比對總黃酮提取率的影響

精確稱取2.000 g 迷迭香干粉5 份，按料液比1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）分別加入濃度50%乙醇，70 ℃回流提取3 h，結果見圖3。

圖3 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on yield of total flavonoids

由圖3 可知，隨著提取溶劑的增加，總黃酮提取率先增大而后減小。當原料一定時，溶劑用量越多原料顆粒周圍濃度越低，細胞壁內外濃度差越大，這樣有利于有效成分的溶出。料液比為1 ∶20（g/mL）時，總黃酮提取率最大。當溶劑用量繼續(xù)增加時，因溶劑揮發(fā)帶來的損失會增大，導致提取率有所減小。故選擇1 ∶20（g/mL）為迷迭香總黃酮最佳提取料液比。

2.4 提取時間對總黃酮提取率的影響

精確稱取2.000 g 迷迭香干粉5 份，按料液比1 ∶20（g/mL）各加入濃度50%乙醇，70 ℃分別回流提取1、2、3、4、5 h，結果見圖4。

圖4 提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on yield of total flavonoids

由圖4 可知，當提取時間為3 h 時，總黃酮提取率最大，繼續(xù)延長提取時間，提取率反而略微減少，并趨于平穩(wěn)，這可能是由于長時間浸提使得部分黃酮類化合物受熱損失。故選擇3 h 為迷迭香總黃酮最佳提取時間。

2.5 提取溫度對總黃酮提取率的影響

精確稱取2.000 g 迷迭香干粉5 份，按料液比1 ∶20（g/mL）各加入濃度50%乙醇，分別于50、60、70、80、90 ℃回流提取3 h，結果見圖5。

圖5 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on yield of total flavonoids

由圖5 可知，在80 ℃以前，總黃酮提取率隨溫度的升高而逐漸增大。當溫度達到80 ℃時，提取率最大。隨著溫度的繼續(xù)升高，總黃酮提取率反而下降，這是因為高溫下溶劑揮發(fā)，浸提效果變差，同時部分黃酮類物質可能被破壞，導致提取率的減小。故選擇80 ℃為迷迭香總黃酮最佳提取溫度。

2.6 正交試驗

選取乙醇濃度、料液比、提取時間和提取溫度進行四因素三水平正交試驗。正交試驗因素水平見表1，正交試驗設計及結果見表2。

由表2 可知，4 個因素對總黃酮提取率影響的主次順序為B＞C＞A＞D，即料液比＞提取時間＞乙醇濃度＞提取溫度。提取條件的最優(yōu)組合為A2B2C2D3，即乙醇濃度為50%，料液比為1 ∶20（g/mL），提取時間為4 h 和提取溫度90 ℃。在此條件下，3 次重復試驗，迷迭香總黃酮提取率達6.31%。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗設計及結果Table 2 The design and results of orthogonal test

3 結論

通過單因素及L（934）正交試驗確定迷迭香總黃酮最佳提取工藝條件：乙醇濃度為50%，料液比為1 ∶20（g/mL），提取時間為4 h 和提取溫度為90 ℃。在最佳提取工藝條件下，提取率為6.31%。

[1]江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典[M].上海：上海科技出版社,1986：1738-1739

[2]鄭漢臣,蔡少青.藥用植物學與生藥學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2004：127-129

[3]包輝,王照友,王贊.黃酮類化合物研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].科技風,2011(10)：163

[4]吳建章,郁建平,艾長春,等.迷迭香中微量元素與黃酮類化合物的含量分析[J].光譜實驗室,2008,25(4)：627-629

[5]劉琦,辛秀蘭,蘭蓉,等.金花葵花中總黃酮提取工藝的研究[J].食品研究與開發(fā),2011,32(7)：19-21

[6]田國政,何義發(fā).薇菜葉總黃酮提取工藝條件優(yōu)化[J].食品科學,2010,31(22)：283-285

[7]查甫本,陳向明.山核桃外果皮黃酮提取條件的研究[J].合肥學院學報,2009,19(3)：68-71