謝 靜,周文富,張茶妹

(三明學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,福建三明365004)

微波輔助法提取馬尾松樹皮總黃酮的研究

謝 靜,周文富,張茶妹

(三明學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,福建三明365004)

以水為溶劑采用微波輔助輻射法提取了馬尾松樹皮總黃酮。以蘆丁標(biāo)準品為對照品,用分光光度法測定馬尾松樹皮總黃酮的含量;探討了料液比、微波輻射功率、微波輻射時間、浸提時間、浸提溫度等因素對馬尾松樹皮總黃酮提取率的影響,通過正交實驗得出微波輔助提取馬尾松樹皮總黃酮的最佳條件為:料液比1∶25(g∶m L)、微波輻射功率350 W、微波輻射時間3×40 s(間歇3次)、浸提時間4 h、浸提溫度60℃,在此條件下,總黃酮提取率達到3.08%。微波輔助下以水為溶劑提取馬尾松樹皮總黃酮高效、快速、經(jīng)濟,具有較好的實用價值。

馬尾松樹皮;總黃酮;微波輔助提取

馬尾松(學(xué)名Pinus massoniana Lamb.)在我國松樹種中分布最為廣泛[1],砍伐后的馬尾松樹皮僅用作燃料或直接丟棄,沒有得到很好的利用,而樹皮中含有豐富的藥用成分(如原花青素等),是值得開發(fā)的資源寶庫[2-4]。藥理研究發(fā)現(xiàn):馬尾松樹皮提取物不僅具有較高的營養(yǎng)價值,更有抗氧化、抗衰老、抗突變及預(yù)防DNA損傷之功效[4-9]。其中的黃酮類化合物不僅具有多種生物活性和藥理作用,而且具有抗氧化、抗衰老等功能,由于它來自天然植物,相對安全,是重要的食品添加劑[5-10]。目前國際上對黃酮類化合物的研究開發(fā)十分活躍,其產(chǎn)品種類繁多[6-14]。

文獻報道馬尾松樹皮總黃酮類化合物均采用有機溶劑提取,成本高,無法推廣應(yīng)用。為降低成本,作者以水為溶劑采用微波輔助法提取馬尾松樹皮總黃酮,探討了料液比(g∶m L,下同)、微波輻射功率、微波輻射時間、浸提時間、浸提溫度等因素對馬尾松樹皮總黃酮提取率的影響,確定了馬尾松樹皮總黃酮的最佳提取條件。擬為更好地開發(fā)利用馬尾松資源提供參考。

1 實驗

1.1材料、試劑與儀器

馬尾松樹皮,福建三明地區(qū)。

蘆丁標(biāo)準品、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁等,均為分析純。

LWMC-205型可調(diào)功率微波化學(xué)反應(yīng)器,南京陵江科技開發(fā)有限責(zé)任公司;SHB-3型循環(huán)水式多用真空泵,鄭州杜甫儀器廠;DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上?；|試驗儀器設(shè)備有限公司;H.H.S型電熱恒溫水浴鍋,上海醫(yī)療器械五廠;722s型可見分光光度計、FA1604N型電子天平,上海精密科學(xué)儀器有限公司;UV-2550型紫外可見分光光度計,廈門精藝興業(yè)科技有限公司;360型FTIR紅外光譜儀,美國Nicolet公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準曲線的繪制

1.2.1.1 標(biāo)準溶液的配制

稱取蘆丁標(biāo)準品(真空干燥至恒重)10.2 mg,加入適量的60%乙醇在超聲波清洗器上超聲10 min使之溶解完全,定容于100 m L容量瓶中,搖勻,得0.102 mg·m L-1的蘆丁標(biāo)準溶液,置于冰箱貯存,備用。

1.2.1.2 最大吸收波長的確定

在200～600 nm波長范圍用紫外可見分光光度計對顯色后的蘆丁標(biāo)準溶液進行掃描。結(jié)果顯示,標(biāo)準溶液在500 nm處有最大吸收值,因此,確定最大吸收波長為500 nm。

1.2.1.3 標(biāo)準曲線的繪制

精確量取蘆丁標(biāo)準溶液0.0 m L、0.5 m L、1.0 m L、2.0 m L、3.0 m L、4.0 m L、5.0 m L分別置于25 m L容量瓶中,各加60%乙醇至5.0 m L;分別加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 m L,搖勻,靜置6 min;分別加入10%硝酸鋁溶液1.0 m L,搖勻,靜置6 min;再分別加入4%氫氧化鈉溶液5.0 m L,并用60%乙醇稀釋至刻度,搖勻,靜置15 min,在500 nm處測定吸光度。以蘆丁含量(c,μg·m L-1)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線,并進行線性回歸,擬合得到線性回歸方程為:A=-2.6280×10-4+0.01346c,R= 0.9999。

1.2.2 馬尾松樹皮總黃酮的提取

將馬尾松樹皮干燥后粉碎(過40目篩),準確稱取3.00 g粉末置于錐形瓶中,加入定量蒸餾水,搖勻,以保鮮膜封閉瓶口,設(shè)置微波功率為350 W,間歇微波作用3次,每次40 s,再置于60℃水浴中浸提4 h,減壓抽濾,濾液定容至100 m L,搖勻,為供試品溶液,顯色后測量吸光度。

首先固定其它條件不變,依次考察料液比、微波輻射功率、微波輻射時間、浸提時間、浸提溫度對馬尾松樹皮總黃酮提取率的影響。然后在單因素實驗基礎(chǔ)上,選擇浸提時間、微波輻射功率、料液比、微波輻射時間為考察因素,進行4因素3水平的正交實驗,進一步優(yōu)化提取條件。

1.2.3 樣品含量的測定

精密吸取供試品溶液1 m L,置于25 m L容量瓶中,按1.2.1.3方法測定吸光度。根據(jù)回歸方程,得到黃酮含量,進一步按下式計算馬尾松樹皮總黃酮提取率:

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 料液比對總黃酮提取率的影響(圖1)

圖1 料液比對馬尾松樹皮總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids in Pinus massoniana bark

由圖1可以看出,提取率隨著料液比的減小(即溶劑量的增大)而升高。這可能是由于,當(dāng)溶劑量較少時,馬尾松樹皮總黃酮在水中的溶出率較低,造成提取率低;隨著溶劑量的增多,黃酮溶出率增大,直至達到飽和,因此提取率也逐漸升高至趨緩?？紤]到能耗,選取料液比為1∶20、1∶25、1∶30作為正交實驗的考察水平。

2.1.2 微波輻射功率對總黃酮提取率的影響(圖2)

圖2 微波輻射功率對馬尾松樹皮總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of microwave irradiation power on extraction rate of total flavonoids in Pinus massoniana bark

由圖2可以看出,當(dāng)微波輻射功率小于350 W時,隨著微波輻射功率的增大,總黃酮提取率升高;當(dāng)微波輻射功率大于350 W后,隨著微波輻射功率的增大,總黃酮提取率反而降低。這可能是由于,微波輻射功率較小時,加大微波輻射功率有助于黃酮的提取;但功率增大到一定程度,會破壞黃酮類物質(zhì),提取率反而降低。選取微波輻射功率為300 W、350 W、400 W作為正交實驗的考察水平。

2.1.3 微波輻射時間對總黃酮提取率的影響(圖3)

圖3 微波輻射時間對馬尾松樹皮總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of microwave irradiation time on extraction rate of total flavonoids in Pinus massoniana bark

由圖3可以看出,總黃酮提取率隨著微波輻射時間的延長先升高后降低,在微波輻射時間為40 s時最高。這是由于,微波輻射時間過短,黃酮類物質(zhì)還未充分溶出;隨著微波輻射時間的延長,黃酮溶出量逐漸增大;40 s以后,未溶出的黃酮類物質(zhì)的量很少,提取率變化不明顯?？紤]到生產(chǎn)成本和能耗,選取微波輻射時間為30 s、40 s、50 s作為正交實驗的考察水平。

2.1.4 浸提時間對總黃酮提取率的影響(圖4)

圖4 浸提時間對馬尾松樹皮總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of soaking time on extraction rate of total flavonoids in Pinus massoniana bark

由圖4可以看出,隨著浸提時間的延長,提取率逐漸升高;浸提超過4 h后,提取率反而有所下降。這可能是由于,浸提時間太短,有部分黃酮來不及溶出,延長浸提時間可使其繼續(xù)溶出;而浸提時間太長,則會使溶出的黃酮分解,致使黃酮提取率降低。因此,選取浸提時間為4 h、5 h、6 h作為正交實驗的考察水平。2.1.5 浸提溫度對總黃酮提取率的影響(圖5)

圖5 浸提溫度對馬尾松樹皮總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of soaking temperature on extraction rate of total flavonoids in Pinus massoniana bark

由圖5可以看出,總黃酮提取率隨浸提溫度的上升先升后降,在浸提溫度為60℃時最高。這可能是由于,浸提溫度升高,分子的熱運動速度加快,浸提速度加快,黃酮提取率升高;但浸提溫度過高時,提取液的活性成分在微波條件下遭到破壞,提取率反而降低。因此,選擇適宜的浸提溫度為60℃。

2.2 正交實驗結(jié)果與分析(表1)

表1 正交實驗的結(jié)果與分析Tab.1 The results and analysis of orthogonal experiment

由表1可知,各因素對總黃酮提取率的影響大小依次為:料液比＞微波輻射功率＞浸提時間＞微波輻射時間,選取較優(yōu)水平為A1B2C2D2,即料液比1∶25 (g∶m L)、微波輻射時間40 s(間歇3次)、微波輻射功率350 W、浸提時間4 h。為了驗證正交實驗結(jié)果的可靠性,平行做3組驗證實驗,平均提取率為3.08%,進一步確證正交實驗結(jié)果可靠。

2.3 光譜分析

2.3.1 紫外光譜分析(圖6)

由圖6可以看出,馬尾松樹皮總黃酮提取物的兩個吸收峰的位置及吸收譜線的形狀與蘆丁標(biāo)準品非常相似,吸收峰均出現(xiàn)在230～280 nm和340～400 nm波段,表明馬尾松樹皮總提取物的結(jié)構(gòu)與蘆丁黃酮相似。

圖6 蘆丁標(biāo)準品(a)和馬尾松樹皮總黃酮(b)的紫外光譜Fig.6 The UV spectra of rutin standard(a)and total flavonoids in Pinus massoniana bark(b)

2.3.2 紅外光譜分析(圖7)

圖7 蘆丁標(biāo)準品(a)和馬尾松樹皮總黃酮(b)的紅外光譜Fig.7 The FTIR spectra of rutin standard(a)and total flavonoids in Pinus massonians bark(b)

由圖7可以看出,蘆丁標(biāo)準品和馬尾松樹皮總黃酮的紅外光譜的特征峰基本相似,3422.72 cm-1處為-OH的較強伸縮振動吸收峰;1619.39 cm-1、1446. 55 cm-1處為苯環(huán)的吸收峰。進一步說明馬尾松樹皮總黃酮結(jié)構(gòu)與蘆丁相似。

3 結(jié)論

(1)微波輔助下水法提取了馬尾松樹皮總黃酮類化合物,通過單因素實驗和正交實驗確定最佳提取條件為:料液比1∶25(g∶m L)、微波輻射功率350 W、微波輻射時間3×40 s(間歇3次)、浸提時間4 h、浸提溫度60℃,在此條件下,一次提取率達到3.08%。

(2)微波輔助下,以水為溶劑提取馬尾松樹皮總黃酮,不僅高效、快速,且克服了傳統(tǒng)提取方法使用有機溶劑、提取費用高的缺陷,具有較好的實用價值。

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Microwave-Assisted Extraction of Total Flavonoids in Pinus Massoniana Bark

XIE Jing,ZHOU Wen-fu,ZHANG Cha-mei
(College of Chemistry and Biological Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China)

Total favonoids in Pinus massoniana bark was extracted by microwave-assisted extraction using water as solvent.With rutin standard as reference substance,flavonoids content in Pinus massoniana bark was determined by spectrophotometry.The effects of solid-liquid ratio,microwave irradiation power,microwave irradiation time,soaking time,soaking temperature on extraction rate of total flavonoids in Pinus massoniana bark were studied.The optimum conditions of microwave-assisted extraction of total flavonoids in Pinus massoniana bark were obtained through single factor experiment and orthogonal experiment as follows:solid-liquid ratio of 1∶25(g∶m L),microwave irradiation power of 350 W,microwave irradiation time of 3×40 s(intermittent 3 times),soaking time of 4 h,soaking temperature of 60℃.Under above conditions,the extraction rate could reach 3.08%.Microwave-assisted extraction of total flavonoids in Pinus massoniana bark with water as solvent was rapid,efficient and economic.

Pinus massoniana bark;total flavonoids;microwave-assisted extraction

TQ 461

A

1672-5425(2013)01-0036-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.01.09

福建省6.18成果技術(shù)企業(yè)招標(biāo)項目[2010]

2012-10-02

謝靜(1989-),女,福建菁田人,碩士研究生,研究方向:中草藥提取分離改性;通訊作者:周文富,教授,E-mail:zff79@sina.com。